Transgene živali: tehnologija

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - Transgene živali in primerjalno embriologijo

Za razliko od rastlin, če obstaja možnost pridobitve plodna sredstva iz transformiranih somatskih celic in kloniranje, proizvodnja transgenih živali - zelo zahteven in dolgotrajen proces.

Strategija uporablja, kot sledi:
1. kloniran gen uvedemo v oplojenega jajčeca jedra.
2. oplojenega jajčeca z eksogeno DNA se vgrajujejo v ženski prejemnika (od uspešnem zaključku zarodka sesalcev v drugih okoliščinah nemogoče).
3. Bleed potomci razvila iz vsajenih jajc, ki vsebujejo kloniran gen v vseh celicah.
4. skew živali, ki nosijo kloniran gen v celicah zarodno linijo in dajejo nove genetsko linijo.

Poskusi na gensko spremenjenih večceličnih organizmov z uvedbo transgene v njih zahteva veliko časa. Vendar Transgenska postala močno orodje za študij molekulske osnove izražanja genov in razvoj sesalca, ustvariti modelnih sistemih, ki omogoča študijo bolezni pri ljudeh, kot tudi gensko spremenjenega mlečnih žlez živalskih celic za proizvodnjo mlečne beljakovine pomembne za zdravila. Tam je bil tudi nov izraz "Pharming» (Pharming), ki se nanaša na postopek priprave mleka transgenih živali avtentične človeške beljakovine ali zdravil.

Uporaba mleka, je smotrno, saj je nastala v telesu živali v velikem številu in lahko nadaivat, kot je potrebno, ne da bi škodovali žival. Produkcija mlečne žleze in izloča v mleku ne mora nova beljakovina torej izvajati nikakršnih negativnih učinkov na normalnih fizioloških procesov v transgene živali, in podvržemo post-translacijskih sprememb, da se vsaj blizu tistim v človeških celicah. Poleg tega je njegova izolacija iz mleka, ki vsebuje še druge beljakovine, ne sme biti preveč težko.

Kljub temu, da so bili prvi transgena žival, pridobljenih v letu 1985 je uvedba ga eksogeno DNA v pronuclear zygotes še ni razvila učinkovito metodo, ki se lahko uporablja za ustvarjanje gensko spremenjenih živali, ne glede na vrsto in namen poskusa. Razvoj novih učinkovitih načinov prenosa genov v embrionalnih in somatskih celic živali, kot tudi izboljšanje obstoječih pristopov je nujna naloga.

Med veliko različnih načinov uvajanja eksogene DNA v genom živali je mogoče razlikovati, ki se pogosto uporabljajo v praksi transgenih:
- Postopek mikroinjiciranje,
- retrovirusni posredovan genski transfer,
- modifitsirovanngh uporabo izvornih celic,
- Prenos transformirane jeder generativnih in somatskih celic
- uporaba semenčic in spermatogonijev kot vektorji DNA.

Med drugimi metodami zagotavljanja eksogene DNA v organizem živali lahko ugotovi z uporabo liposomov, adenovirusnih vektorjev, kot tudi visoke hitrosti metode injiciranja. Vendar pa te metode ne uporablja pogosto zaradi njihove nezadostne stabilnosti in pomanjkanje integracije transgena v genomu.

Mikroinjiciranje rekombinantne DNK v oplojenih jajčnih celic iz večceličnih živali so še vedno najbolj priljubljen način za vnos tujih genov v živali. Kljub temu, da je ta metoda zahteva veliko znanja in drage opreme, preprostost in zanesljivost plačujejo vse svoje pomanjkljivosti.

Prvi in najbolj uveljavljeno eksperimentalni sistem za pridobivanje transgenskih živali je bila miš. Darovalca miši ženskega spola s poskusnim Superovulacija parijo s samci proizvodnjo, potem ko je bil 12 ur izoliramo oplojenih jajc in damo v kulturi. Nadalje smo injicirali rekombinantno DNA (sl. 2.17) večja od dveh pronuclei (običajno moški). Preživeli vbrizgati jajce presadimo v samico prejemnico. Samo del od presajenih jajčnih celic še naprej razvijal do telitve.

Sl. 2.17. Mikroinjiciranje eksogenega DNA v pronucleus oplojenih jajčec sesalcev pod mikroskopom (a) in postavitvi preskusa (B)

Pogostost vključevanja eksogenega DNA z uporabo metode mikroinjiciranje vplivajo dejavniki, kot čistosti injiciranje vzorca, oblike in koncentracije DNA, sestava puferske raztopine za mikroinjiciranje, kakovost zarodkov, in postopek za prenos zarodkov prejemnika (nonsurgical, kirurški, laparoskopsko).

Transgene živali so opredeljene v potomcev različnih metod, večina PCR in parijo pridobiti transgenih linij. Nekatere transgene živali so mozaik (zarodnih celic ne vsebujejo eksogeno DNA), ki jo prečkajo transgensko zato je manjši del prve generacije potomcev od izračunane 50%. V nekaterih primerih, homozigotne linije ni mogoče dobiti, ker transgenih vstavki 5-15% homozigotno smrtonosno, saj je vstavljanje včasih krši vitalne dele genoma.

Natančen mehanizem za vključevanje injiciranega DNA v kromosomih ciljnih celicah, ni znan, toda analiza vstavljenih strukture DNA razkriva določene točke. Integracija pojavlja naključno na enem kromosomski lokus, ki lahko vsebuje enega do več tisoč tandemskih kopij integrirano DNA. Približno 30% primarnih transgenih živali, pridobljenih običajno kažejo določeno stopnjo mozaika, ki je lahko posledica vključevanja eksogenega replikacije DNA po prvem ciklu.

Stopnja vključevanja eksogenega DNA v genom, t.j. Število transgenih živali od skupnega števila rodil živali metodi mikroinjiciranje, odvisno od vrste razlikuje na majhnem območju od 5-15%. Najbolj pomembno, ker so stroški potrebni za proizvodnjo enega transgene živali je transgena Skupni indeks učinkovitosti, ki se izračuna kot razmerje med pridobljene transgene živali skupnega števila presajenih zarodkov, izražen kot odstotek. Vrednost indeksa za sesalce tudi relativno konstantna na povprečno ~ 0,5% za prašiče in krave do okoli 2% pri miših.

Retrovirusni vektorji se uporabljajo tudi za ustvarjanje transgenih živali. Okužbe preimplantiranih zarodkov rekombinantni retrovirusi - razmeroma preprost učinkovit postopek.

Vosmikletochnuyu morula (sl. 2.18) sprosti iz jajčne lupine in damo v posodo kulture z fibroblastov proizvajajo rekombinantni retrovirus. Okužene zarodkov dosežena stopnja blastula so vsadili v pseudopregnant ženskah. Kot rezultat so transgene organizme nastane, mozaike po številu in lokaciji vgradnih ins rekombinantne DNA v genom. Zato, da dobimo čisto proge nadalje zahteva tujeprašnih obsežno.

Slabost te metode je, da se omeji vstavljanje eksogene DNA ~ 8 potrošniškega blaga, pri čemer je lahko transgen biti brez sosednjih regulatornih zaporedij, ki so potrebni za njegovo ekspresijo in v nekaterih primerih, vključijo v originalni lokusu nestabilno.

Novi lentivirusna vektorji (lentiviruse spadajo v družino retrovirusov) so pokazali, da so zelo visoko učinkovitost pri zagotavljanju DNK v jajčnih celic in zygotes. Vbrizgavanje rekombinantnih lentivirusna konstruktov v perivitelline prostor prašičev zygotes in govejih jajčnih celic za posledico pojav potomcev z najvišjo trenutno režnja transgene živali. Istočasno, lentivirusni vektor vso slabosti retrovirusni: insercijo eksogene DNA in večkratne integracije v genom gostitelja, ki lahko vodi do neželenih stranskih učinkov, kot je aktivacija onkogenov in insercijsko mutagenezo majhnosti. Poleg tega, lentivirusni vektor za visoko stopnjo mozaičnega transgene mladičev ter njihove posamezne dejstva dušenje zvoka (inaktivacije) rekombinantni lentivirusni sekvence pridobljeni transgenih linij.

Uporaba retrovirusnih vektorjev ima eno veliko pomanjkljivost. Čeprav so ti vektorji povzročajo, da so replikacijsko defekten retrovirusni sev genom (pomožni virus), ki je potrebna za pridobivanje velikih količin DNA vektorja lahko sodijo v isto jedro, kot je transgena. Kljub vseh sprejetih ukrepih, lahko retrovirusi pomočniki bodo ponovili v transgene živali, ki je popolnoma nesprejemljivo, če bi te živali se uporabljajo kot hrana ali kot orodje za pridobitev komercialni izdelek. In ker so alternativne metode transgenezo, so retrovirusni vektorji redko uporabljajo za ustvarjanje transgenih živali, ki imajo tržno vrednost.

Sl. 2.18. Shema za pridobitev linije transgenih miših z retrovirusni vektorji

Spremenjene izvorne celice zarodkov se lahko uporabi za pridobitev transgene živali. Celice so izolirane iz mišjih zarodkov na stopnji blastociste, lahko proliferirajo v kulturi, hkrati pa ohranja zmožnost razlikovanja v kateri koli tipov celic, vključno z linijskim celic kalčkov, kadar jih dajemo v drugi zarodka na stopnji blastociste (sl. 2.19).

Takšne celice se imenujejo pluripotentnimi matičnimi celicami zarodka (-i). ES-celice v kulturi lahko uvedejo ciljne transgenu različne tehnike (transfekciji, elektroporacijo, retrovirusni okužbe, itd), ne da bi motili njihovo pluripotency. Praktično Prednost tega sistema je, da daje veliko priložnost za izbiro celice po določenem parametru. To je lahko število kopij transgena, njene lokalizacije in vzorcev izražanja.

Poznavanje sekvenco, ki obdaja določeno mesto za želeno povezovanje lahko zgradi vektor za vstavitev ciljne DNK s homologno rekombinacijo. Na primer, zamenjava gena, ki kodira prepoznavna indikacije za namene izbiri z odstranjevanjem njegov ali ponovni vzpostavitvi funkcije v dobljeni transgene celice.

Na enak način, tako imenovani knockout miši (knock) - miši z inaktiviranim smerno posebno celični gen za študij svojo funkcijo. Za izvedbo homologna rekombinacija vektor je izdelana iz ciljne genskih fragmentov, ki se načrtuje, da onesposobijo del ciljnega gena nato nadomesti izbirni označevalec za izbor celic z integriranim oblikovanja.

Sl. 2.19. Priprava transgene miši z rekonstrukcijo zarodkov uporabljajo gensko spremenjeni embrionalnih matičnih celic (ES-celic). ES-celice so izvedene iz mase notranje celične a blastociste miške

Izbrani transgene ES-celice lahko kultivirani in se uporablja za proizvodnjo transgene živali. To preprečuje nenamerno vstavljanje transgena, ki je značilen za metodo in mikroinjiciranje proteina retrovirusni vektor sistemov.

Vse prejete v okviru sheme mozaiki živalih, ki so tako potrebni za rejo delo za pridobivanje čistih linij. Primarni problem mozaik transgene živali je mogoče premagati s presajanjem jedra transformirane ES-celice v enucleated jajčnih celic, ki so se nato nadaljevali svoj normalen razvoj. Kot rezultat, v vsako celico živali, pridobljenih vsebuje transgen.

Na žalost, pluripotentnimi ES-celice, ki so podobne miško, dokler ne boste našli v drugih sesalcev in ptic, vendar je iskanje nadaljuje.

Jedrska prenos transformirane generativnih in somatskih celic v jajce, ali somatsko jedrski prenos (somatsko prenos jedrska), druga metoda, uporabljena v praksi transgenezo. Pokazalo se je, da je jedro embrionalnih celic različnih živali, ko se je preselil na enucleated jajčeca včasih sposobna zagotoviti razvoj novega organizma. Po kratkem gojenje so tudi jedro nekaterih diferenciranih celic lahko zagotovili razvoj uspešnega posameznika.

Na primer, znani ovca Dolly smo klonirali v letu 1997 združitve kultivirani (3-6 prehodi) dojke epitelijske celice (vime) odraslih živalih šest let brez jajčeca jedra (sl. 2.20). Čeprav ne moremo izključiti možnosti, da je kloniranje pomotoma vzeli nediferencirane celice prisotne v epitela donatorjev.

Sl. 2.20. Kloniranje ovc za jedrski prenos. Breast epitelijske celice v kulturi je induciran na fazo G0 (stopnja na kateri jajce). Potem, fuzija teh celic z enucleated jajčnih celic in zarodkov, so zrasla do zgodnjih fazah embriogeneze. Po katerem so zarodki vsajeni v maternico nadomestni materi, kjer je nadaljnji razvoj poteka. V poskusu smo J. Wilmut (I. Wilmut) kloniranje izvaja podporno 277 m enucleated jajčne celice z prsnih celic v fazi G0 od 29 preživelih zarodkov razvit le en izvedljiv organizma

Voziček Kloniranje diferenciranega celičnem jedru in preostalih treh ovce s embrionalnih jedrih celic lahko izvaja s prenosom jedra iz celic, ki so v fazi mirovanja (G0), in po možnosti značilnosti embriogenezo živali. V ovac zygotes v prvih treh oddelkov, ki zasedajo nekaj dni, samo da pride do podvajanja DNK, nobeden od gena ni izražena. Predpostavlja se, da je uvedena DNA, v tem času sprosti iz celice specifične regulacijske proteine in ustreznih genov so povezane z embrionalni razvoj zarodka iniciator proteinskih faktorjev iz citoplazme v jajce.

Medtem ko so kloniranje tehnologije še vedno zelo daleč od popolnosti - klonirali Dolly razkriva številne znake prezgodnjega staranja, je zelo obetavno tehnologijo za proizvodnjo transgene živali. Tudi če obstajajo različne težave s prvo generacijo, najverjetneje, druga generacija ne bo imela pomanjkljivosti, pridobljene z uporabo "staro" za jajčni jedra.

Glavni problem je treba rešiti, da bi ustvarili nobenih transgene živali, ki uporabljajo metodo jedrske prenosa je bil pravi, - je ohranjanje pluripotentnih celic v neprekinjenem kulture. Trenutno aktivno išče dejavniki reprogramiranje diferencirane celice za indukcijo pluripotency. Če mu uspe, bo genska sprememba teh celic in ustvarjanje transgenih organizmov s somatskimi jedrske prenosom postala skoraj rutinski postopek, in medtem ko so ti izolirani uspešni poskusi.

Umetni kromosomi kot transgena vektorja. Večina transgeni so cDNA majhne geni (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Glede na vse to, je uporaba jekla za transgeni kvasni umetni kromosom (YAC), ki obdaja delce genomske dolžine DNA 100 do > 1000 potrošniškega blaga in umetne kromosomi še večje zmogljivosti (okoli umetnih kromosomov). Te episomsko vektorji imajo še eno prednost - prepreči položaj učinek genskega izraza, ko je eksogeni DNA. Stopnja izražanje vstavljenega gena je zelo odvisna od njegove kromosomski položaju, na primer vdelavo neaktivni kromatin (heterokromatin) nepoškodovane kromosom vodi v genski inaktivacijo.

Uporaba kvasovk umetnih kromosomov (YAC), nosi več sorodnih genov ali velik gen, smo transgenih miših ustvari mikro injiciranjem v pronucleus oplojenega jajčeca ali s transfekcijo ES-celic. Transgenih miši, ki nosijo skupino petih funkcionalno človeško globin genovv skupni dolžini približno 250 potrošniškega blaga, vseh teh genov so izražene tkivo posebej in ob pravem času Točno na enak način, kot to počne pri ljudeh. Tako ravnanje je zagotovljena njihova sosednjih zaporedij, ki vsebujejo promotor in druge predpisane elemente pomembno. Uporaba YAC-transgenih miših Dobimo da sintetiziramo Samo humana protitelesa tetramerni kompleksna struktura dveh parov različnih polipeptidnih verig.

Človeški umetna kromosomi (humani umetni kromosom -HAC), ki vsebuje celotno humani imunoglobulin lokusa s težkih in lahkih verig uvedemo v govejih fibroblaste, ki se nato uporabi za somatsko prenosa jeder. Sprejeti transkhromosomalnye teleta izražanje humanega imunoglobulina v krvi. Ta sistem je bil pomemben korak v smeri živinoreji terapevtskih človeških poliklonskih protiteles.

Nadaljnja opazovanja transgenih živalih so pokazale, da so rekombinantni HACs ohranil pri večini prve generacije posameznikov več let. Ali ni prejela umetnih kromosomov pravilno ločevanje med mejozo in podedoval, to bomo še videli.

V zadnjem času, nova obetajoča tehnologija za živali invalidnih genov - male interferenčne RNA (siRNA, siRNA), ki se uporabljajo za ugašanje, katerih namen gene (utišanje). RNA interferenca - konzervativna posttranskripcijsko regulatorno proces. Dvoverižna Mala interferenčna siRNA pri 19-23 nukleotidov veže specifično na njeno komplementarno zaporedje predlogo ciljni mRNA, jo usmerja vzdolž degradacije poti.

RNA interferenca je del regulacije gena sistema, in sicer kontrolami / zavira prevajanje mRNA od endogenih in eksogenih virusnih elementov in se lahko uporabijo za terapevtske namene. Za prehodno gen zaustavitev sintetičnih so siRNA transfektirali v celice ali zgodnjih zarodkov. Za stabilno genski represijo treba siRNA sekvenco vključiti v genom kot del ekspresija genskega konstrukta izvedeni.

Zelo učinkovita kombinacija lentivirusna vektorjev z siRNA za vključitev v genomu. V nasprotju s klasičnim knock-out strategijo, ki zahteva dolge plemenskih linij pridobiti čisto inaktivirano gen tako loci diploidnega genoma siRNA Integracija lahko enostavno izklopite ciljni gen v vseh živali na voljo linijo.

Kljub številnih metod, razvitih za pridelavo transgene živali, do zdaj ni zanesljive in učinkovite tehnologije za transgene živali. Največje težave so povezane z vstavitvijo naključnega eksogene DNA v genom z večino obstoječih metod. Tako, da še dodatno kakovost tehnologije, izboljšanje potrebno razviti opažanja spreminjanja celične gene in natančno vstavljanje eksogene DNA v genom.

Bolj, da je večina genomi gospodarsko pomembnih organizmov, ki ga zdaj v celoti zaporedje in lahko načrtujejo prihodnjo strukturo transgene organizma. Kombinacija popolnoma dekodirajo zaporedjem nukleotidov z metodami ciljano dajanje eksogenega DNA dopušča gradnjo transgenih ciljnih genomov z vnaprej določenimi lastnostmi.

NA Bojevniki, TG Volova

Zdieľať na sociálnych sieťach:

Príbuzný