GuruHealthInfo.com

Medicinsko pravo: pravo, dokumente, odgovornosti, pravila, akti.




zdravstvena zakonodaja


UtverzhdenyGlavnym gosudarstvennymsanitarnym vrachomRossiyskoy federacija -first zamestitelemMinistra zdravoohraneniyaRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO9 januar 1998 godaData uvod - 8 junij 1998 goda4.2. METODE nadzora. Biološka Mikrobiološka Diagnoza davici FAKTORYLABORATORNAYA INFEKTSIIMETODICHESKIE UKAZANIYAMU 4.2.698-981. Zvezni uradniki oblikovan referenčni - laboratoriidiagnostiki davica infektsiiMoskovskogonauchno Raziskovalni inštitut za epidemiologijo in mikrobiologijo im.G.N. Gabrichevskogo (MD Mazurova IK, MD Melnikov k.b.n. Kombarova S., O. Borisova) in DepartamentomGossanepidnadzora Rusko ministrstvo za zdravje (Žilina NY 0,2). Odobreni in uveljavijo velik gosudarstvennymsanitarnym zdravnika Ruske federacije, prvi zamestitelemMinistra zdravje Ruske federacije od 8. aprila 1998 D.3. VvedenyvzamenMetodicheskihukazaniy4.2.589-96"Laboratorijska diagnoza okužbe davici"0,1. Smernice za področje primeneniyaMetodicheskie pripravijo za pomoč spetsialistambakteriologicheskih sanitarne laboratorije - epidemiologichoskoysluzhby, zdravstveno - vzgojnih zavodih in znanstveno raziskovalni inštitut za izboljšanje laboratornoydiagnostiki davice infektsii.2. Značilnosti povzročitelja davice infektsiiVozbuditelem difteriynoyinfektsiiyavlyayutsya toksigennyeCorynebacterium diphtheriae. Nontoxigenic Corynebacterium davica difteriine okužba vzrok. "etiološki" etihmikroorganizmov pomen pri infekcijske bolezni (žrela, artritis, endokarditis, itd) zahtevajo posebno dokaz. Ko vydeleniinetoksigennyh sevov C. diphtheriae bolnikov s sumom nadifteriynuyu okužbe je treba paziti na pravilnostprovedeniya bakteriološke pregled in oceno, ki temelji na sposobnosti toksigennyhsvoystv.V C. diphtheriae proizvod ekzotoksinlezhit pojav faga na (ali lysogenic) konverzijo. Konversiyanetoksigennyh sevi C. diphtheriae v naoborotvosproizvoditsya strupenih in le v določenih, eksperimentalne pogoje. V tehsluchayah ko med začetnim sejanje materialne izoliranega strupenih otbolnyh davica, medtem povtornyhobsledovaniyah po antibiotično zdravljenje - netoksigennyekorinebakterii davici, je mogoče domnevati, da kadar ispolzovaniiantibiotikov predvsem izginejo toksikološke sevi kakbolee občutljivi za njihovega delovanja, in nontoxigenic shtammyprodolzhayut dodeljena. Enako stanje je mogoče ustvariti in prisanatsii antibiotikov bakterije prevozniki, in hkrati vydelyayuschihtoksigennye nontoxigenic Corynebacterium davico. Odkrivanje Utaka mediji v ponavljajočih anketah le netoksigennyhshtammov ni mogoče razlagati kot izguba sposobnosti shtammovprodutsirovat ekzotoksin.Taksonomicheski tesnem Glede C. diphtheriae so C.ulceransi C.pseudotuberculosis (C.ovis). Ti mikroorganizmi - prirodnyepatogeny govedo in drobnico, konje. Otmechenasposobnost te vrste bakterije proizvajajo toksin podobnyydifteriynomu. Obstajajo tudi "nontoxigenic" sevi. dodelitev Izvestnysluchai "toksigene" C.ulcerans v klinični kartinezabolevaniya podobne difteriey.Na žrela sluznice nosu in normalno chastovstrechaetsyalozhnodifteriynayapalochka Hoffmann (C.pseudodiphtheriticum). Sposobnost za izolacijo in identifitsirovatdannye bakterije služi kot merilo pri ocenjevanju kakovosti rabotybakteriologov interepidemic period.Vse mikroorganizme v rodu Corynebacterium yavlyayutsyagrampolozhitelnymi palice, ki ne tvorijo spor obladayuschimirazlichnoy stopnjo polimorfizma. Večina vrst raste boljše vaerobnyh usloviyah.Obychno kolonije mikroorganizmov rodu Corynebacterium naplotnyh hranilnem gojišču (npr na krvnem agarju) imeyutserovato - Bela ali rumenkasto neprozorno ilipoluprozrachnye, okrogle oblike, premera 1 - 3 mm. Najpogosteje onibyvayut mehko, masleno doslednost, čeprav so nekatere vrste rodakorinebakteriimogutobrazovyvat grobo R-kolonii.Predstaviteli te vrste nimajo visoke fermentativnoyaktivnostyu. C.diphtheriae rastejo na 37sh C, odporno proti nizkoytemperature občutljiv na visoke. Vsi razkuževanje veschestvav navadni koncentracije (3-5%) korinebakteriidifterii uničijo v 20 - 30 minut. Strupenih C.diphtheriae boleechuvstvitelny na antibiotike kot nontoxigenic. Vozmozhnopoyavlenie antibiotikom odpornih sevov. Široko opredelyatchuvstvitelnostkantibiotikam izolatov otbakterionositeley ne sme biti posledica neujemanja rezultatovlaboratornoy vzorca delovanja antibiotikov na telo vozbuditelyadifterii cheloveka.Dlya C.diphtheriae označen s pomembno polimorfizma -raznoobrazie velikost in obliko celic. Celice imajo obliko klubi, loparji, itd oestrus Celica Interpozicija spominja rimskietsifry X, V. Kadar je barva pogosto najdemo vyrazhennayavnutrikletochnaya striation zaradi zerenvolyutina prisotnosti. Opisano afiniteto volutin za metilen modro in ti priobrabotke zrnca barvilo ali trakovi (povezana granul) madež modre barve in v nekaterih protoplazmi sluchayahmozhet pridobitev rozovyyottenok.Ispolzovanievbakteriologicheskoy okraskipoGramuyavlyaetsyanetselesoobraznym prakso ali celo poskolkukletkiC.diphtheriaelegkoobestsvechivayutsya spirtomimogutvyglyadetvmazkegramvariabelnymi gramotritsatelnymi.Dlya C.ulcerans in C .pseudodiphtheriticum sklonnostk značilno vzporedni razporeditvi celic. 24-48 h kulturi etihvidov so pogosto jajčaste oblike kletok.Po tvorijo kolonije in nekateri biokemični svoystvamC.diphtheriae je razdeljen na kulturno - biohimicheskievarianty - gravis, mitis, intermedius.Cherez 48 - 72 ur rast mitis varianto tvori vrsto koloniiS - gladka, premer 1 - konveksnih kolonij 2 mm varianta SR-gravisobychno z dvignjenim center s premerom 2 - 3 mm kolonijah izvedba intermedius - s-, majhna, ravna, gladka, porušen premer roba 0,5-1 mm. V nadaljevanju so opisane le dvakulturalno - biokemično izvedbo - gravis in mitis, tako kakbiovar intermedius redka in biokemični svoystvamne razlikuje od biovar mitis.Na krvi telluritovyh medijev po 48 urah rasti koloniiC.diphtheriae izvedba gravis, kot tudi kolonijo C.ulcerans, črna, mat imajo radialni proge. KoloniiC.pseudodiphtheriticum imajo značilno luč obodok.V bakteriologicheskoypraktikeopiratsyatolko namorfologicheskie lastnosti kolonij ali mikrobnih celic priidentifikatsii C.diphtheriae, ni mogoča. Opisanysluchai bakteriološko hipo- in hyperdiagnostics (55% in 14,5%, v tem zaporedju) kadar se uporablja uchettolkomorfologicheskih znakov. Pri opredelitvi C.diphtheriaeneobhodimo testno uporabo kompleks predvsem patogenosti (toksičnost) Glavni priznakavozbuditelya difterii.Opredelenie toksikološke lastnosti izvaja bacteriologists prvi dan rasti sumljivih kolonij na ploščah pervichnogoposeva materiala. Da bi se izognili napakam pri korineformne bakterije na določitev toksigennyhsvoystv, je treba preučiti to indikacijo umaksimalnogo števila kolonij iz plošč iz osnovnih tehnik skladnosti poseva.Pri spodaj opisanih lahko študiral toksigennostbolee kot 20 sumljivih kolonij iz posamezne analize. Nelzyaizuchat materiala v množini rasti sumljivi koloniytolko eno - dve aktivnosti blyashkah.Fermentativnaya mikroorganizmov vzorčnega putemopredeleniya tsistinazy encim, ureaze, sposobnost, da cepimo dokisloty glukozo, saharozo, škrob. V redkih primerih, kogdaneobhodimo prepoznajo C.ulcerans, dodamo navosstanovlenie nitrata testno nitrity.Uchityvaya da kadar je difteriynoyinfektsii identifikacija patogen vodilni element določitev prisotnosti toksina otsenkidrugihsvoystvimeet pomožne znachenie.Ispolzovanie "dolga" ogljikovih hidratov je število odvečnega priidentifikatsiya C.diphtheriae.Prakticheskimbakteriologam ukvarja z laboratorijsko diagnostiko davici, ne trebuetsyaprovodit identifikacije vrste drugih mikroorganizmov rodaCorynebacterium. Hkrati, v laboratoriju, kjer povzročajo provoditsyadiagnostika bolezni "nedifteriynymi"Corynebacterium, nezadostna uporaba tudi "dolga"ogljikovih hidratov vrstica. Za mikroorganizmovneobhodimo točne identifikacijske podatke uporabljajo chemotaxonomic raziskovalnih metod, kot so zaznavanje prisotnosti mycolic kislin, se celične stene bakterij ter nekatere vsostave drugie.Takim način mikroorganizem izbran vozbuditelemdifterii če ima strupenih lastnostih opredelennymspektrom encimsko aktivnost (cepitev glukozo, škrob, odsotnost saharoze razpadu encim tsistinazy prisotnost, odsotnost fermentaureazy) in značilno morfološko -kult uralnymi znaki (nastanek kolonij na črni ali serogotsveta krovyano - telluritovyh okoljih prilagojena, prineobhodimosti, morfologija celic - polimorfna ne tvorijo sporpalochki) .3. IssledovanieBakteriologicheskoe bakteriološke študije so bile izvedene na laboratornoydiagnostiki okužbe davice, ugotoviti vire okužbe pri razširjenosti toksigene inablyudeniya korinebakteriidifterii.VZYaTIE in dostavo MATERIALA1. Uspeh bakteriološko preiskavo v znachitelnoystepeni odvisen pravočasno in natančno zajemanje materiala.2. Ob materiala posebej obuchennyemeditsinskie zdravstveni delavci - nega uchrezhdeniy.3. V študiji za preučitev orofarinksa in davica nos.Pri difteričnega redkih lokalizacije (oko, uho, rana, koža, nožnice) poleg poškodbe je treba vzeti tudi material iz smindalin nosa.4. Ob materiala izvedemo z uporabo sterilne tamponov vatnyhsuhih. Za njihovo pripravo z leseno ilimetallicheskie (iz nerjavnega jekla) palice, eden kontsovkotoryh dobro rane plast vata (primerno120 mg bombažno krpico). Tamponi mora biti v obliki "kapljice"in ne"vreteno". Tamponi so nameščeni v epruveto z plute ali vatnymiprobkami, tako da je konec tampona ne dotika dna in stenokprobirki. Steriliziramo tamponov v pečici na vroč zrak pri temperature140sh C eno uro ali v avtoklavu pri 0,5 atm. 30 Min.5. Material iz orofarinksa in nosnih brisov, ki individualno prazen želodec ali ne prej kot dve uri po obroku, ko horoshemosveschenii uporabo lopatico, brez dotika bris jezika ivnutrennih ploskve za lica in zob. Ena bris sobirayutmaterial z lezij orofarinksa - tonzile in prineobhodimosti - z oboki mehkega neba, uvula ali žrelu zadneystenki. V prisotnosti zobnih oblog, mora material je treba sprejeti sgranitsy bolnem in zdravem tkivu, rahlo pritiskom na nihtamponom. Pri čemer material iz nosu uporabo drugega palčko, ki je najprej v eno in nato uvedli v drugo nosnico, nekasayas snaruzhi.6 nosnice. Ko laringoskopija materiala (sluzi folija) sobirayutneposredstvenno grla. Material s poškodbami kozhisleduet zbirati suho palčko po odstranitvi skorje ali strupa.7. Tamponi imajo bytdostavleny v laboratoriyunepozdnee 3 ure po zaužitju materiala. Ko provedeniiobsledovaniya kontingenti v oddaljenih območjih bakteriologicheskihlaboratory, je priporočljivo, da se gradivo posadimo na skodelico spitatelnoy okolju ali pa uporabite transportni sredu.8. Pri transportnega medija području sobirayutsuhim blazinico namočeno v epruveti z okoljem in zagotoviti, da je vtič ni mokra tamponom. Upoštevajte, da primenenietransportnoy okolje razširja izdajo končnih otvetana eno sutki.9. Kozarec (ali epruveta s transportnega gojišča) z posevomissleduemogo material, lahko dajo vzreji vtermostat pri 37sh C v času 15 - 18 ur, nakar zagotavljajo vlaboratoriyu.10. Med prevozom na dolge razdalje, kot tamponi mozhnoispolzovat namočeni rastvoromglitserina. Tampon impregnirana s 5-odstotno raztopino glicerina vdistillirovannoy odteče na steno posode z raztopino, izboljšajo in vitro kot tudi suhi Bris in avtoklavu pri0,5 atm. 30 Min.11. Hladna sezona Testni material, ki je podano v vrečah vbaklaboratoriyu - thermoses, da bi preprečili zamerzaniya.12. Vsluchaeneobhodimosti Corynebacterium davice v postmortalnyhissledovany materiala tselesoobraznobrat s mandeljnov, grla in nosne votline kot v vnutrennihorganah redko.13 patogena zaznana. Vsaka cev s testnega materiala (žrelu, nos ilidrugaya lokalizacije) pritrjen na številko. Številka pritrjena cev spiskeukazyvaetsya, priimek, ime (ali začetnice), starost, ime institucije, priročnik material ali doma adresobsleduemogo, namen raziskave (z diagnostičnim ukazaniemdiagnoza, ki temelji na epidemioloških indikacij, preventivno nego), datum ob materiala.HOD RAZISKAVE. PRVA DENPosev materiala.Material za preiskovanje orofarinksa, nazalno ali drugihporazhennyh sedežev ločeno zasejemo na površini gosto medijev hranil izrekomenduemyh, zlijemo v skodelice Petri.Posev z enega lica pripraviti skodelico uporabo prietom polovico površine semenskega srednje izrotoglotki materiala in drugi - za snovi pridelka iz nosu. Ko posevemateriala iz kože ali drugih mestih, dodati še eno skodelico. NI dovoljena materiala pridelek od nekaj posameznikov na chashku.Pri sejanja materiala se podrgnil v mediju od vseh strani tampona nauchastke območje 2 x 1 kvadratnih. cm - oblikovanje takšnih "igrišče"To je treba. Nato je ta isti bris vcepimo ostavshuyusyapoverhnost 1/2 skodelice. Sejanje pogosta neperekryvayuschimisyashtrihami ne da bi odstranili tampon iz površine hranilnem mediju in nespremenljivem položaju tampona. Ta metoda omogoča zaseyatves cepilni material z tampona, da dobimo izolirane kolonije (chistuyukulturu) za nadaljnjo identifikacijo setve neposredno na chashkepervichnogo ki skrajšuje testu odnisutki. Nacepljene plošče ali epruvete, ki vsebujejo transportno mediju pomeschayutv termostat na 37sh C. Setev transportnega medija, da dobimo dedovanje dan gosto srednje tampon ostenki pritisku cevi ali zank, pri čemer se material iz osadka.Posev treba opraviti na ploščah z medijem, temperature ali segretem prikomnatnoy v inkubator (15 - 20 minut) .VTOROY day1. Kolonije, ki rastejo na ploščah, 24 s pomočjo brskanja chasaposle cepilni material (če je material, prevlečeni v drugem polovinednya, se ogled opravi v natanko 24 ur, to je tudi druga polovica dneva), vizualno ali z uporabo stereoskopski mikroskopabinokulyarnogo (MBS) .2. Skodelice z kolonijah, kot so davica, sprejeti dlyadalneyshey prepoznavanje kulture v vseh testih. Mikroskopiipreparatov - brise "sumljivo" Kolonije se lahko neprevodni. "sumljivo" kolonija krovyano - telluritovyhsredah po 24 urah svetlobe rast - siva konveksne porušen robovi, v 48 urah - siva s kovinskim odtenkom, srovnymiili nekoliko nazobčane robove, drobljenje priprikosnovenii zanke ali mehko konsistenco. iz "dvomljive"Kolonije pripravimo pripravke - mazki.Kletki Corynebacterium davice iz kulture, gojeno na sredahs zaviralcev rasti (kalijev tellurite, hinozol) lahko bytukorocheny, odebeljen, vendar pri namestitvi in ​​polimorfizmsohranyayutsya. Ocenjevanje morfoloških lastnosti ne pozvolyaetustanovit vrste mikroorganizma, ampak daetvozmozhnost naj bi ga popeljal do rodu korinebakteriy.Esli mikroskopijo predstava coli značilno rodakorinebaktery, so te kolonije izbrana za dalneysheyidentifikatsii v vseh testih. V primeru druge formmikroorganizmov (koki, kvasa, spore palice), te kolonije dalneysheeizuchenie prekraschaetsya.3. V primeru rasti "sumljivo" podobne kolonije takoj nadaljevati s preučevanjem njihovih lastnosti strupenih svoystv.Toksigennye študija ne manj kot 2 izolirovannyhkolony z zasaditvijo polovico vsakega od kolonij na srednji dlyaopredeleniya strupenost in neogrevane zanke, - na Pisa medij, druga polovica pa kolonij - v cev z prirezani syvorotochnymagarom za ohranjanje in kopičenje kulture. Ko nevozmozhnostisnyat 1/2 kolonije za sejanje na toksičnost in na srednje Pizuispolzuetsya materiala kolonii- celoten pridelek na agarisklyuchaetsya posnet in, še bolj, od cevi kultiviranja sproboy Pisi. Glede na to, da lahko 1/2 ali 1 kolonij po 24 urah rasti velikostih kolonije in industrijska imeyutnebolshie bytnedostatochno za kopičenje toksin davice v natoksigennost vzorca, in da v materialu mogutnahoditsya hkrati toksigene in nontoxigenic raznovidnostikorinebaktery davica, je treba pregledati toksigennyesvoystva ga mogoče, največjega števila kolonij (največ 20), mešamo še 5 - 7, podobno enem blyashku.4 kolonij. Če je mogoče, da vzorec nastavitev toksigennostklassicheskim metodo (glej. P. 3) zaradi nezadostnega velichinykolony, študija, mešanje iste vrste kolonije neskolkihblyashkah. Ne gori skozi zanko, inokulirano sredo Pisi. Skodelice spervichnym setvijo test material smo ponovno postavi vtermostat 24 ur in jih ponovno brskanje (z tretisutki) .5. Če samo ena kolonija raste, se lahko sejejo nasredu za določanje strupenosti in brez gorenja zanke na stolbiksredy Pisi za določitev tsistinazy. Identifikatsiimozhno za nadaljnjo uporabo kulture cev z vzorcem ali Pisi blyashkicherez 48 ur rasti ali 24 ur rasti pri vyyavlennyhtoksigennyh kultury.6 lastnostmi. Da bi se izda predhodno odziv sumljivih kolonij rasti sluchaemnozhestvennogo lahko proizvestiposev več kolonij v tekočih srednje dlyapostanovki Phragmites, Sachse dopolnitev dodaten vzorec (3 -5 podobni kolonij držimo po 30 minutah inkubacije.) In Pisa vzorca (5 - 6 podobne kolonije obračunavanje skozi 3 urah inkubacije). Priharakternoy za Corynebacterium davice v morfologiji MBS kolonij, morfologijo celic z mikroskopijo, Sachse negativni vzorec, vzorčne pozitivne rezultate Pisa, Phragmites lahko vydatpredvaritelny odziv odkrivanje kulture sumljivih nakorinebakterii davici po 48 urah (tretji dan) z sejalne momentapervichnogo raziskovali materiala.TRETY day1. Po 24 urah, ko je specifična liniypretsipitatsii na mediju za določanje strupenosti, polozhitelnoyprobe na tsistinazu, proučevanih kulturni označene kakkorinebaktery strupenih difteričnim in oddajanje dokumentirovannyyotvet.Pri odsotnost posebnih precipitacijsko progah srednje dlyaopredeleniya toksičnost, smo plošče inkubirali nadaljnjih 24 chasa.2. Kultura goji na agarju poševno ali seruma sproby Pisa (po oceni njegove čistosti) zasejemo v mediju dlyaopredeleniya biokemijske izvedbi (saharoza, glukoza, škrob) ifermenta ureaze (sečnina hidroliza) 0,3. Plošče, katerih glavni inokulacijo issleduemogomaterialaprosmatrivayut vizualno ali s ponovno MBS 36 -48 urni inkubaciji v inkubatorju. V navzočnosti "sumljivo"Kolonije študij svojih strupenih lastnostih tsistinaznuyu dejavnost ivydelyayut čiste kulture na agar skoshennyysyvorotochny (cm. Druga študija dan, str. 3) .Če ne kolonijah osumljenih korinebakteriidifterii, dokončno odziv, Corynebacterium difteriine vyyavleny.Pri ni rasti na agar začetne sejanje cherez48 urni inkubaciji v nekaterih primerih zahteva ponavljajočo pokazal iissledovanie materiala. Popolna odsotnost rasti pogosto vsegosvidetelstvuetonarusheniipravilbakteriologicheskogoobsledovaniya (prevzemu, sadilnega materiala in kultivirovaniyaissleduemogo) .CHETVERTY dan (ali peti) 1. Pri posebni precipitacijsko linije dlyaopredeleniya toksičnost okolje (24 urah inkubacije, vzorci natoksigennost 48 urno rast primarnega sejanje) polozhitelnoyprobe njih tsistinazu dokumentirano odgovor vydeleniitoksigennyh difterii.2 corynebacteria. Kultura goji na agarju poševno ali seruma sproby Pisa po določitev njegove čistosti, inokuliramo na nosilcu dlyaizucheniya biokemične lastnosti (sikanje mediju s saharozo, glukozo, škrob, Sachse vzorca s sečnino ali juhi) .3. Spet (po 48 urah) upoštevajo rezultati natoksigennost vzorca postavljeno med 2. dan študije. Odnovremennoproizvodyat saccharolytic vodenja lastnosti in vprobah ureaze dejavnosti, določenih v 3 dni issledovaniya.Pri odsotnosti posebnih precipitacijskimi linij 48 chasovposle počivališča vzorce za strupenost, vendar polozhitelnyhrezultatah vzorcev za tsistinazu, glukoze, sečnine negativno rezultatahprob in saharoze, kulture ugotovljenih kakkorinebakterii davica nontoxigenic, označuje biohimicheskogovarianta.Pri izolacijo toksigene Corynebacterium difteriidopolnitelno dal odgovor o biokemičnem Propert tvah (ili96 72 ur po začetnem sejanje materiala) .BAKTERIOLOGICHESKOE ZAKLYUCHENIE1. Prisotnost specifičnih precipitacijsko vodov z opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitiven test za tsistinazu, negativnega testa za ureaze, kultura ibiohimicheskie značilnimi lastnostmi (saharoza, glukoza, škrob) pozvolyayutzaklyuchit ki se nanaša na izoliranih kultur korinebakteriydifterii um toksigene, biokemijske ali mitis.2 izvedba gravis. Odsotnost posebnih precipitacijsko vodov z opredeleniitoksigennyhsvoystv, pozitivna reakcija na tsistinazu, negativnega testa za ureaze, kultura ibiohimichekie značilne lastnosti nam omogočajo zaključiti, da izoliranega kulturaotnositsya do vrste Corvnebacterium davica, nontoxigenic, biokemijske ali mitis.3 izvedba gravis. V navzočnosti precipitacijsko linijami enaka kontrolni spetsificheskimliniyam seva Corvnebacterium difteričnim, polozhitelnyhprob ureaze, tsistinazu, glukoze in škroba fermentacije, odsotnost saharoze fermentacije vnitrity nobenega zmanjšanja nitratov, kultura spada k korineformne ultserans moti strupenih variant.Pri ne precipitacijsko linije pri določanju toksigennyhsvoystv in ti so vse ostale lastnosti značilne dlyakorinebaktery ultserans se, nontoxigenic možnost ibakteriologichesky odgovor šteje za negativno ym.4. Ko izberete Corynebacterium Gofmanailidrugihdifteroidov, otritsatelnym.5 bakteriološko odgovor verjeti. V nekaterih primerih, ko je diagnostični pregled in poepidpokazaniyam, lahko predhodni odgovor dati. Etotrebuet nastavitev dodatne vzorce, prisotnost kachestvennyhpitatelnyh okoljih, testne - naprave za proizvodnjo in Phragmites spetsialnoobuchennogo osebja. Začasna odziv se lahko izda za večkratni rasti podobne prinalichii "sumljivo" koloniyna začetna sejanje jedi po 24 urah inkubacije (glej. vtoroyden študije, n. 6) lahko .Predvaritelny odziv zamenjati po okonchaniyabakteriologicheskogo issledovaniya.6. Sevi iz Corynebacterium davici atipichnymimorfologicheskimi, mora biokemičnih, lastnosti toksikološke Corynebacterium ishtammy ultserans treba nasloviti na federalnuyureferens - laboratorij za diagnozo okužbe davica priMoskovskom Research Institute of Epidemiology in mikrobiologije im.G.N. Gabrichevskogo za nadaljnji študij (125.212 Ul admiral Makarov, 10). Shema BAKTERIOLOŠKO studies1 denPosev issleduemogomateriala na selektivnuyudifferentsialno - diagnostični ali, če je potrebno, vtransportnuyu mediju. Inkubacija v inkubatorju pri 37sh C.2 dan (24 ur) 1. Študijski kolonije, če je to mogoče - na postanovkaproby toksičnost, tsistinazu in setev kulture skoshennyysyvorotochny agar.2. Pri uporabi transportnega medija mora biti proizvestiperesev na selektivnem diferenciala - diagnostični sredu.3. Ko multipla rast, če -dodatni potrebi mozhnoprovesti študije za izdajo predhodnega odgovor vzorec Pisa, Sachse in pridelek "sumljivo" koloniyv tekoči medij za odkrivanje toksin davice vRNGA.3 dan (48 ur) 1. Dobičkonosnost Analiza vzorcev za strupenost in tsistinazu določene na drugi dan študije. Če nalichiyaspetsificheskih padavin linij in pozitiven vzorec Pizuvydayutdokumentirovannyyotvet toksigennyhkorinebaktery dodelitev difterii.2. Setev čisto kulturo izberemo drugega denissledovaniya, Hiss v mediju študija biokemične lastnosti (saharoza, glukoza, škrob, urea) .3. Ponovno pregledati (48 ur) primarna posevavizualno skodelici ali z MSB. Počivališča testi za toksičnost, tsistinazu in pregledovanje kolonij seruma agar.4 prirezani. V primeru prometnega okolja, je seveda issledovaniyasm. začenši z n. 1 drugi dan in nato pri skheme.5. Vydachabakteriologicheskogootvetaobotsutstviikorinebaktery difterii.6. Pri določanju RNGA odkriti toksin davice prinalichii pozitiven rezultat pri tej reakciji in odkrivanje uissleduemoy kultura tsistinazy encimskega odsotnosti fermentaureazy lahko dobimo predhodno odziv za dodelitev vozbuditelyadifterii.4 dan (72 ur) 1. Obračunavanje kulturo strupenih lastnostih izbranih v denissledovaniya 3 (po 48 urah rasti primarnega sejanje) in odzivom dodeljevanja vydachadokumentirovannogo toksigene korinebakteriydifterii. Sejanje kultur izbrani za določitev biohimicheskihsvoystv (saharoza, glukoza, škrob, urea) .2. Računovodski kultura biokemične lastnosti (toksigene ilinetoksigennoy) razporejeni v drugi dan študije (cherez24 urna inkubacija začetna sejanje) .Vydacha bakteriološki odziv netoksigennyhkorinebaktery razporeditev davice označuje idopolnitelnogo pomočjo izvedbenih biokemijsko odziv biokemijskih lastnosti difteričnega toksigennyhkorinebaktery dodeljenih ranee.5 dan (96 ur) izdajanje dodelitev bakteriološkega odziva (48 chasovinkubatsii začetna sejanje) ali toksikološke netoksigennyhkorinebaktery davici y Azan biokemični varianta.4. Metode za identifikacijo patogena difteriynoyinfektsiiOPREDELENIE toksigene KORINEBAKTERIYDIFTERII znamke, ki uporabljajo obarjalno reakcijo pri postopku, ki temelji na gel za določanje strupenosti korinebakteriydifterii (Elek test) leži Postopek immunodiffuziitoksina števec in antitoxic protiteles v gostem hranilnem mediju. Namesto optimalnega kvantitativne korelacije med toksin, ki ga proizvaja Corynebacterium in antitoksin nafiltrovalnuyu prevlečenega papirja je njihova interakcija z obrazovaniempretsipitata kot belo črto ali "brki".Toksigennost Corynebacterium davica določen, običajno v čisti kulturi (ali kulturo posameznih kolonij s skoshennogoagara ali vzorec Pisa). Zmes kolonije ali kulture zagryaznennyepostoronneymikrofloroy se lahko preveri tudi natoksigennost. Ker je v tem primeru, gel obori vagarovom izkušnje je treba ponoviti z namensko chistymikulturami.Dlya produkcije vzorcev za toksičnost mora imeti: sterilno petrijevko z ravnim dnom, hranilnem mediju - agarMartena ali suhe mediju poslovna hranilnem normalnuyusyvorotku goveda kri, sterilna izfiltrovalnoy papirni trakovi merijo 1,5 cm x 8 cm, ochischennyyfermentolizom specifično sorpcijo in difterični antitoksin (vdalneyshem iz antitoksin) protivodifteriynuyuantitoksichesk TH konjskega seruma, terapevtska (v dalneyshemimenuetsya antitoxic seruma) ali izdelanega papirja diskis antitoksin uporabljajo zanje, in - kontrolnyytoksigenny Corynebacterium davice sev 24-48 ur rosta.Prigotovlenie kozarčki za določanje probyna toksigennostPitatelny agar za določanje strupenosti tselesoobraznorazlivat cevi 10 ml (količina, potrebna dlyaprigotovleniya eno skodelico). Pri večjih količin delovne pitatelnyyagar porazdelili v fiole v 70 - 80 ml (7 - 8 vzorec skodelice natoksigennost). Hranilni agar je treba rasplavlivat tolko1 multiple drugo taljenje zmanjšuje lastnosti medija. Pitatelnyyagar rasplavlivayut v vodni kopeli pri 90 SH C, takoj izbani odstranimo, ohladimo na 50sh C in dodamo govedo 20% seruma krupnogorogatogo. Tako je bila do 10 ml hranilnega agarja dodamo 2 mlsyvorotki govedo, mešamo in zlijemo aseptično v sterilno petrijevko, skrbno rotacija chashki.V središče dnu raspredelyayutsosedu čašo na površino trdilnega agar obozhzhennympintsetom je objavljen trak filtrskega papirja propitannuyuantitoksinom ( ali antitoxic seruma) .Chashku osušimo v peči pri 37sh C 15 -20 min., če ga obrnemo. Pri uporabi bumazhnyhindikatornyh vozi hranilni agar ploščo suhega donaneseniya sredy.Chashki plošče na površini gojišča za določitev strupenosti shranjevanje nerekomenduetsya.Prigotovlenie papir polosokPoloski filtrirnega papirja reši v velikosti 1,5 cm x 8 cm, ovit z 2 - 4 kosov v vrečki in steriliziran v avtoklavepri 0,5 atm 30 minut. Vrečke s papirnato poloskamihranyat v sterilno petrijevko do 3 nedel.Pered odrnih vzorcev na vsebino toksičnost santitoksinom viale raztopimo v 1 ml sterilne fiziologicheskogorastvora, prenesemo v sterilno epruveto in kažejo neydannye etikete (raztopili antitoksin temperature4 shranimo pri - 6sh C, ki ne presega 10 dni) . Filter papir obozhzhennympintsetom damo v sterilno petrijevko. Na vsakem poloskunanosyat antitoksin 0,25 ml vsebuje 500 ME v 1 ml. Dlyaudaleniya presežek serumu navlažimo trakovi uporabljajo ksterilnoy skodelico pokrov Petri.Pri uporabo razstrupljanju seruma (vmestoantitoksina) zahteva njegovega razredčiti do 500 ME 1. ml.Razvedenie antitoxic syvorotkiSoblyudaya aseptične postopke, antitoxic viale perenosyatiz serumu v sterilno epruveto. Na cev kažejo dannyeetiketki in rok uporabnosti. Shranjevanje serum pri 4 -6sh treba C.Syvorotka razredčimo s sterilnimi vsebino fiziologicheskimrastvorom 500 MG v 1 ml. Komercialni pripravek mozhetimet drugo aktivnost (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) in razlichnyyobem.Naprimer v ampuli vsebuje 10.000 ME (v volumnu 4,8 ml, golu kakukazano etiket z ampul) antitoxic syvorotki.Dlya poenostavi izračune, lahko celotna količina seruma biti vzeti za5 ml. Zato v 1 ml seruma vsebuje 2000 ME (10000 ME: 5 = 2000 ME). Da bi dobili 500 MG v 1 ml sleduet1 ml seruma razredčenega 4-krat, t.j. 1 ml seruma dobavit3 ml sterilne fiziološke raztopine. Ko neobhodimostimozhno razredčimo v serumu v manjših količinah: 0,1 ml syvorotkidobavit do 0,3 ml fiziološke raztopine ali 0,2 ml syvorotkidobavit 0,6 ml fiziološke raztopine ali 0,3 ml syvorotkidobavit 0,9 ml fiziološke raztopine in t. d.Razvedenie serum se lahko opravi na drug način. Če je, na primer, vsebovan v ampuli 5000 ME seruma v volumnu 2,5 ml, ki je ME 500 vsebuje 0,25 ml seruma. V ta obsega dobavlyayut0,75 ml sterilne fiziološke raztopine in seruma poluchayutrazvedenie 500 MG se 1 ml.Razvedennuyu serumu shranjena za 7 dni pri temperature4 - 6sh C.POSTANOVKA PROBYKulturu cepimo v "plošče" premer 0,6-0,7 cm narasstoyanii 0,7 - 0,8 cm narazen in 0,5 cm od roba poloskifiltrovalnoy papirja. Ena skodelica je treba ne posadili več kot 10 "plošče". Od teh, 6 "plošče" test kulture 4 -kontrolnogo sev. Ko majhno količino inokulirano ispytuemogomateriala 6 kontrolo "plošče" in 4 - predmeti (slika 1. *>). Skodelice s setvijo damo v termostat pri 37sh C .-------------------------------- *> Ni privoditsya.Uchet rezultatovRezultat odčita pri 18 - 24 in 48 urah se rosta.Sleduet razume chtopreparatantitoksicheskoyprotivodifteriynoy serum, poleg difteriynomuantitoksinu protiteles vsebuje protitelesa proti antigenov v formulaciji mikrobne kletki.Poetomu vzorca na toksičnost ispolzovaniemdannogo z izločkov drog lahko tvorimo ne le vrezultate povezovanje toksin s antitoksina (spetsificheskiepretsipitaty), ampak tudi v interakciji antibakterijskih protiteles skomponentami corynebacteria celic d ifterii (nespetsificheskiepretsipitaty). Slednje se lahko oblikuje se kot toksigene, napačno številko in sev nadzor ter na netoksigennyhkorinebaktery davice. Včasih je videz mnozhestvennyhliny padavin. Nespecifično precipitatov običajno blagi imajo nejasen obris zdi najbolj 48 -72 ur, v redkih primerih se lahko pojavi v prvem sutki.Kriteriem ocenili specifičnost zlitjem izločkov je liniypretsipitatsii preskus sev specifičnih liniyamikontrolnogo toksigenske. V primerih, ko ukontrolnogo sev oblikovanih več vrstic padavin, bi bilo treba posebno upoštevati bolj natančno in zgodaj poyavlyayuschiesyapretsipitaty. Zato si vzorčne skodelice na toksigennostosuschestvlyayut po 18 - 24 urah od trenutka njene proizvodnje. Če se vtechenie tem času na nadzorni sev pretsipitatsiine liniji zazna, da predstavlja kršitev usloviypostanovki reaktsii.Varianty oceniti odziv rezultatov: 1. test kulture Corynebacterium davica yavlyayutsyatoksigennymi if tvorijo padavin linije združiti iliimeyut tendenco, da se združijo z ustrezno kontrolno spetsificheskimiliniyami strupenih shtamma.2. test kulture Corynebacterium davice yavlyayutsyanetoksigennymi if: a) linija padavin tvorjen testne kulture, odsotni prisotnost določenih progah obarjanjem ukontrolnogo sev b) linijo padavin ni mogoče spojiti z spetsificheskimiliniyami kontrolno obarjanje seva in prečka ali imeyuttendentsiyu križanja z njimi (nonidentical , nespetsificheskielinii) -c) vrstice vrstice precipitacijsko test kulture snespetsificheskimi združiti kontrolni sev-d) obarjanje preskus vrstice kult URS sospetsificheskimi linije križajo in združili z nespecifično liniyamikontrolnogo shtamma.Ochischenny encimska hidroliza in specifično sorpcijo antitoksin ne vsebuje protitelesa proti komponent mikrobnih celic. Ko ispolzovaniietogo pripravo nespecifični precipitacijsko črt ne obrazuyutsya.METODIKA toksigene SVOYSTVKORINEBAKTERY DOLOČANJE z difterijskim INDIKATORNYHBUMAZHNYH disk s površino ANTITOKSINOMNa petrijevko z medijem za mikrobnega objavljen opredeleniyatoksigennosti difteričnim kazalnik kolesa sdifteriynym antitoksin. Približno vsak disk 5 antitoksinomformiruyut "plošče": dve "plošče" - krmilno sev in tri -ispytuemye (ena analiza vsaj dva sumljiva koloniyamiformiruyut "plošče" iz izoliranih kolonij in -od zmesi 3 - 6 koloniy- Podobne slike iz istega analizamozhno poteka okoli druge antitoksin diska). Vseh pet"plošče" razporejena simetrično okrog lističa na razdalji 0,8 smot njenega roba. Premer vsakega "plošče" 0,8 cm. V eni lončka Petrimozhno sprejme do štirimi koluti antitoksin in v tem zaporedju 20 "plošče" kultur. Skodelice z posevamipomeschayut v termostatu pri 37sh C.Rezultat reakcijo odčita pri 18 - 24 ur, 48 ur -Neprekinjene. Prisotnost padavin linij med santitoksinom diska in test kulture kaže eetoksigennosti. Študija obravnava toksična kultura, obarjanje ta kultura esliliniya prehaja pod kotom linieypretsipitatsii kontrolnih sev. Pomanjkanje padavin linij uispytuemyh kultur po 48 urah, če imajo kontrolnyhshtammov kaže ne strupenost imajo izuchaemyhkultur. precipitacijsko črto v kontrolnih sevov dolzhnypoyavlyatsya po 18 - 24 ur. Slednje izgled liniypretsipitatsii zahteva preverjanje hranilni medij kontrolo kakovosti ilizameny shtamma.Hranenie kontrolnega seva v laboratoriiDlya nadzor shranjevanja seva v laboratoriju mozhnoispolzovat poltrdna agar seruma, pripravljenega nabulone Martin ali druge juhe hranil (pH 7,6). Naj vholodilnike ponovna zasaditev enkrat na 2 - 3 mesece. Polutekući agarrazlivayut 8 ml epruvete in 1 ml govejega syvorotkikrupnogo skota.Kontrolny toksigennyyshtammkorinebaktery davici izvedbi gravis pridobljeni v državi Research Institute standardizacije ikontrolya medicinske in biološke preparatovim.L.A. Tarasevich. V sojenja o strupenosti ni mogoče uporabiti vkachestve nadzor, proizvodnja sev PW-8 in je treba redno varianty.Kontrolny sev pasaže na krovyanomagare. Za uspešno identifikacijo corynebacteria difteriikontrolny toksigenske kultivirajo vsak 1 - 2 sutok.METODIKI DEFINICIJE PRIZNAKOVOPREDELENIE TSISTINAZNOY biokemičnega delovanja (vzorec Pisa) Corynebacterium difteričnim in corynebacteria ultserans, unlikefrom lozhnodifteriynoy Hoffmann in druge palice korineformnyhbaktery posest encim tsistinazoy.Ispytuemuyu kultura cepljen zanko "kurac" . V pitatelnuyusredu za določitev tsistinazy, zlijemo v ozek višine probirkistolbikom 3 cm hranilni medij sestavka ima cistina ocetne - kislino povzroči. Med produtsiruettsistinazu za rast kultur, odcepitev tsistin- in tvorjen na etomserovodorod reagira z ocetno - kisline svinca, žvepla v kotoryyprevraschaetsya - svinčene - Spojina -Brown temne barve. Corynebacterium davico in korinebakteriyultserans ne samo povzroči Pocrnjenje medija med injiciranjem, vendar iobrazuyut temen oblak okoli njega - rjava narasstoyanii približno 1 cm od srednje ploskve. Reaktsiiuchityvayut Rezultati po 24 urah. V navzočnosti multiple dlyapolucheniya rast pospešena odziva (v 3 urah), pri čemer gojišče kulture inokuliruyutbolshim znesek. Hkrati ispytuemymikulturami, mešanje izvede v kontrolnih sev otdelnuyuprobirku.OPREDELENIE ureaze AKTIVNOSTILozhnodifteriynye Hoffmann coli, Corynebacterium ultserans inekotorye drugimi mikroorganizmi rodu Corynebacterium, da dobimo obladayutsposobnostyu med rastjo irasscheplyat encimskega sečnine ureaze. Corynebacterium davice kot sposobnost neobladayut.Probu ureaze se lahko dajo v dveh variantah - po metoduZakse (a) in z nasaditvijo v brozgi s sečnino (b) .a) Za metodo ureaze Sachse Extempore smeshivayut1 odseka reagenta A in 19 delov reagenta B. zmes zlijemo v 0,1 ml uzkieprobirki izdelavo ene zanke in testiranje čisto postrani cevi kulturyso agar ali Pisa mediju. Za odgovor vydachiuskorennogo v prisotnosti multiple rasti na pladnju odnotipnyhkolony začetne sejanje, kolonije dovoljeno vnesenieneskolkih ena cevki ureaze. Rezultatuchityvayut po inkubaciji v inkubatorju pri 37sh C 30 min.b) čiste kulture Corynebacterium davice v smochevinoy inokulirali brozgi, zlijemo v epruvete v 2 - 3 ml, in damo v inkubator, rezultat po 24 urah inkubacije pri 37sh C.Ferment ureaze cepi iuglekisloty sečnine, da se tvori amoniak. S tem se poveča pH medija in se pojavlja izmenenietsveta indikator (rdečica). V odsotnosti tega encima issleduemoykultury, medij ne obarvanje proiskhodit.Rekomenduetsya istočasno v posebni cevi, zasevatkontrolny shtamm.OPREDELENIE saccharolytic AKTIVNOSTIDlya identifikacijsko Corynebacterium davice takzheotsenku uporabo saccharolytic aktivnost izoliranih kultur za sredahGissa ogljikovih hidratov - saharoza, glukoza, topnega krahmalom.Kazhduyu cevi z medijem sikanje smo inokulirali z 1 zanke chistoykultury. Rezultat po 24 urah in pri otritsatelnomkrahmalnom znaka - tvorjena kisline, je obnova razbarva fuksina in sredapriobretaet barvo Crimson po 48 urah kultiviranja obreže vtermostate na 37sh C.Pri fermentiramo ogljikove hidrate. Priporočena stavitprobu istočasno s sev nadzor Corynebacterium davice variantagravis.OPREDELENIE nitrat reduktaze AKTIVNOSTISposobnost Corynebacterium davici obnovijo soliazotnoy kisline (nitrat) v soli dušikove kisline (nitriti) je izbirno funkcijo, ki omogoča differentsirovatkorinebaktery ultserans.Proizvodyat gojitve v raziskavi v epruveto z nitratnymbulonom, inkubirali 24 ur pri 37sh C.Zatem dodamo 2 - 3 kapljice reagenta do nitrita (Griess iliKasatkina ). Če je bil nastanek nitrita, sredaokrashivaetsya rdeče. Če ne obladaetnitratreduktazoy mikroorganizem, medij ne obarvanje proiskhodit.Odnovremenno s epruvete, inkubiramo kontrolnuyuprobirku sterilno sredoy.5. SredyKachestvo hranljivo gojišče je bistvenega pomena, ko študija lyubombakteriologicheskom. Da bi dosegli maksimalnoyvysevaemosti Corynebacterium davico testnega materiala, morate ustvariti optimalne pogoje za rast, razmnoževanje etihbaktery ohranjanje njihovih bioloških lastnosti, kot tudi dlyaingibirovaniya, ki spremlja rast mikroflore. To dostigaetsyaputem uporabo univerzalne baze hranil z dobavleniemkrovi in ​​kalijevega tellurite. Kalij tellurite v opredelennoykontsentratsii ne zavirajo rast predstavniki rodakorinebaktery in skoraj popolnoma zavre rastno gojišče so postoronneymikroflory.Krovyanyetelluritovye takzhedifferentsialno - diagnostični kot koloniikorinebaktery na teh medijev imajo sivo ali črno barvo (ti mikroorganizmi lahko obnovi kalijev tellurite dometallicheskogo telurjev črno snov, in akumuliranje egovnutri celice) .NPO "hranil mediji", Makhachkala suhuyuhinozolnuyu proizvaja razliko - diagnostični sreda Buchina dlyavydeleniya Corynebacterium davica, ki je pripravljena po naetiketke predpisovanju z dodatkom 5% krvi (št dobavleniesyvorotki namesto krvi). Buchina Sreda slabše krovyanymtelluritovym sredah za zaviralnega delovanja in koloniivozbuditelya davici se lahko pojavijo dan kasneje kot nakrovyanyh telluritovyh okoljih. V zadnjih letih se je prikladnoymikrobiologii Research Institute (.. N Obolensk Moskva regija) pitatelnuyusredu proizvaja izolirati Corynebacterium davici - korinebakagar.Odnako, v primerjavi s krvjo telluritovymi okoljih dannoysrede rastejo v 2 - 3-krat manjših kolonijah korinebakteriydifterii.Uchityvaya zgoraj, še vedno, pitatelnymisredami najboljše za primarnega cepljenja materiala so krovyanyetelluritovye medij. Kot osnova za te agar mediji mozhnoispolzovat suha hranil (SPA) NPO"hranil mediji" (Makhachkala) o hranilni agar osnovepankreaticheskogo hidrolizat, ribja moka (RM) proizvodnja GNIIPM (n. Obolensk). Hranilni agar pripravimo z oznako predpisovanju iextempore doda kri in tellurite kaliya.Dlya presojo strupenih lastnostih corynebacteria difteriivypuskaetsya komercialno suho sredo OTDM (NVO "Pitatelnyesredy"..., Makhachkala) in GNIIPM (n Obolensk Moskva regija) podatke mediji, ki jih etiketke.Luchshey recept na podlagi priprave vzorcev iz okolja in za opredeleniyatoksigennosti Pisi pripravljene ostaja odprto ognjišče pepton, kotoryygotovitsya v laboratoriju ali v oddelkih prehranske srednekotoryh znanstveno - raziskave institucije za prigotovleniyaMartenovskogo agara.Dlya osipa kolonij in kultiviranje Corynebacterium davica vlaboratornyh pogoji pripravo seruma agar sredu.Primenenie serum je zložen netseleso braznym.Kazhdaya novo serijo gojišča (komercialnih iprigotovlennoy vitro) podlezhitbakteriologicheskomu kontrolo. V primerih, kjer hranilni medij rostovyesvoystva ne izpolnjujejo predyavlyaemymtrebovaniyam, hranilnem agarju baze pripravimo brozgo -suhoy hranilni bujon (SPB) z NPO izdelan "Pitatelnyesredy" (Makhachkala), časovno-bulonproizvodstvaGNIIPM (n Obolensk.) - juha aminopeptide za mikrobiološke tseleyproizvodstva klavnice (mesto St., Armavir, Stavropol ') in juhe, pripravljene v laboratoriju (Hottinger Digest, pepton 1% voda, vsebnost aminnogoazota 150 -. 180 mg /%) Gojišča za začetno sejanje sloja chashkamPetri zlijemo v 3 - 4 mm. Uporabljajo se lahko v techenie3 dneh, če je shranjena pri pripravi na temperaturo 4sh C.METODY in hranilne MEDIA REAKTIVOVTRANSPORTNAYA medijev (media akumulacija) kot podlaga za pripravo prometa sredyispolzuyut 0,1% hranilnega agarja na Hottinger prebavo ali 0,1% agarja komercialno hranilna brozga se pH 7,6.0,1% lokaciji agar zlijemo v epruvete v 4 ml sterilizuyutv avtoklavu pri 1 bar 20 minut. čas skladiščenja - do 1 meseca pri 4sh C. Pred uporabo je vsaka cev ssoblyudeniem aseptične postopke, dodamo 0,5 - 1,0 ml syvorotkikrupnogo govedo in 0,05 ml (1 kapljica) 2% kalijevega rastvoratellurita. Selektivno kontrolo okolja sterilnosti vzdrževanje pri 37sh ° C 48 ur. Rok gotovoysredy - 10 dni na 4sh C.ZHIDKAYA hranilnem mediju za NAVEDBA namene RNGAS toksin davice indikacija RNGA materiala chashkipervichnogo setvijo cepljen v epruveto s tekočim srednje syvorotochnoypitatelnoy pripravljeno brozgo temelji Martina ssoderzhaniem aminsko dušik 150 - 180 mg /% pH 7,6. Pitatelnyybulon zlijemo v epruvete v 3,5 ml, sledi avtoklaviranje pri1 ATM steriliziramo. 20 min. rok - do 1 meseca. pri temperature4sh porabi C.Pered vsake cevi z ozirom pravilaseptiki dodamo 0,5 ml govejega seruma i0,05 ml (1 kapljico) 2% -ne raztopine kalijevega tellurite. Kontroliruyutna sterilnim medijem in shranjeni na enak način kot za primarno Poltekoča transportnuyusredu.SREDY cepilni preiskovalno MATERIALASreda Clauberg IIK 100 ml sterilnega hranilnega agarja bazami (pH 7,6), stalimo in ohladimo na 50sh C, glitserinovoysmesi 10 ml, 50 ml "lak" Kri in 3 ml 2% raztopine tellurite kaliya.Prinimaya upoštevati, da hranilni medij in zmes razvoditsyaglitserinovoy "lak" kri v 1,6-krat bi moral dati srednje priprigotovlenii povečana v tehtal suhogopitatelnogo agar izračun 1.6 raza.Primer. Nalepka na viali s suhim kommercheskimpitatelnym agar vsebuje stehta potrebne za prigotovleniyaodnogo liter medija D. Na primer 30 Priprava 1 litrapitatelnoy podlaga za medij Clauberg II, bi morala biti navesku48 g (t.j. 30 g x 1,6 = 48 g) .Za Hrana glicerin zmes s 40 ml krvi ali defibrinirovannoykrovi zmesi dodamo 20 ml kemično chistogosterilnogo glicerina (glicerol sterilizirano pri 110sh temperaturi Savanoriu Str 30 min.). za pripravo "lak" Kri sterilnoydistillirovannoy 34 ml vode dodamo 16 ml defibrinirane krovi.KROVYaNOY TELLURITOVY agarju (KTA) in 100 ml sterilnega hranilnega agarja bazami (pH 7,6), stalimo in ohladimo na 50sh C, dodamo 7 ml 10 mldefibrinirovannoy ali hemolizirali kri in 2 ml 2% raztopina kalijevega tellurite. Pač pa se kri uporabi zmesi suhuyutelluritovuyu (11 ml na 100 ml medija), pri 100 mlKTA ExTemporu medtem, dodamo 1 ml 2% raztopine kalijevega tellurite, t.k.1 ml 2% raztopine že v krvi telluritovoysmesi 11 ml. Ob upoštevanju, da je hranilni medij razvoditsyakrovyu približno 1,1-krat, pri pripravi srednje sleduetuvelichit tehtal suho agar hranil izračun 1.1 raza.Primer. Nalepka na viali s suhim kommercheskimpitatelnym agar vsebuje stehta potrebne za prigotovleniyaodnogo liter medija, npr mora 30 F. Za pripravo 1 litrapitatelnoy podlage CTA vzeti vzorec 33 g (t.j. 30 g x1,1 = 33 g) .METODIKA PRIPRAVO KROVYANYHI KROVYANO - priprava TELLURITOVYH SMESEYDlya hranil medijev najboljših ispolzovatdefibrikirovannuyu krvi živali - goveda, konj, prašičev, ovac, zajcev. Kri zberemo v sterilnyesosudy z biseri uporaba posebej nameščen sistem aseptično. V nekaterih primerih smo zbrali kri, nemontiruya posebne sisteme, ki združuje prvo krvna moka vnebutyli.Mozhno uporabo človeške krvi veljavnosti (citrat in konzervansi) pripravo njih spetsialnyekrovyanye zmesi. Za to je potrebno, da odstranimo tekočo chastotstoyavsheysya krvi, ki vsebuje natrijev citrat in konzervansov. Kostan eritrocitov masa v posodi dodajanje sterilnyyfiziologichesky rešitev, ki lahko odstrani posleosedaniya eritrocitov in dodamo destilirano vodo dopervonachalnogo obema.Horoshim syremdlyapolucheniya zmesi krvi sluzhiteritrotsitarnaya maso, ki lahko ostane, ko proizvodstvegammaglobulina in drugih krvnih proizvodov. Do eritrocit massedobavlyayut sterilno destilirano vodo s hitrostjo 1/3 obemaeritrotsitarnoy massy.Mozhno uporabiti tudi krvne strdke preostalih posleserologicheskih reakcije (z negativnim rezultat reakcija) strdkov ali abortnoy placente kri. Vsterilnye strdki zbiranje steklenic s steklenimi kroglicami in razbito steklo, in potem zamrznjeni in odmrznjeni, nato strdki lahko razbivayutsyabusami. Ta postopek se lahko ponovi 2 - 3-krat. Potem dobavlyayutsterilnuyu destilirano vodo pri stopnji 1/4 zmesi volumen krvi sgustkov.V po zgornjem postopku, pripravljene, kalijevega tellurite dodamo kot konzervans. Za vsako 10 mlkrovyanoy zmesi dodamo 1 ml 2% raztopine kalijevega tellurite. Takuyukrovyano - telluritovuyu mešanica je mogoče shraniti na 4sh C izračun w2 mesyatsev.Primer. Razen supernatant citratom krvi obemom250 ml 50 je bila odstranjena - 60 ml tekočega dela, potem neobhodimodobavit enako število - 50 - 60 ml sterilnogofiziologicheskogo raztopina, premešamo spet pustimo stati, nakar odstranimo 50 - 60 ml tekočega dela in 50 - 60 mlsterilnoy destilirane vode. Tako bo polucheno250 ml zmesi krvi. To je potrebno za ohranjanje dobavit25 ml 2% kalijevega tellurite (za vsako 10 mL krvnega smesipribavlyayut 1 ml 2% kalijevega tellurite) .V nadaljnjo pri pripravi krvi telluritovoy sredyna vsak 100 ml hranilnega agarja Dodamo 11 ml zmesi krovyanoytelluritovoy (10 ml zmesi krvi in ​​1 ml rastvoratellurita 2% kalija). Extempore v takem mediju smo nadalje dodamo 1 ml 2% raztopine kaliya.Prigotovlenie raztopine tellurite tellurite kaliyaDlya telluritovyh mediji se uporabljajo pripravljena kommercheskiy2% raztopina tellurite kaliya.Pri odsotnost komercialno dostopnega raztopine tellurite kaliyagotovyat sledi: 100 ml destilirane vodyrastvoryayut 2 g kristalinične kalijevega tellurite. Za sterilizatsiirastvor segretega v vreli vodni kopeli 30 minut. in obdržati pritemperature 4shC. Kristalni kalijev tellurite hranyatgermeticheski zaprt bančni temno agarja stekla.SYVOROTOChNY AGARSyvorotochny uporablja za presejalne kolonije ikultivirovaniya Corynebacterium davici, lahko pripravimo dovolj radi gornje hranila osnov.K 100 ml stalimo in ohladimo na temperaturo 50sh Cpitatelnogo agar (pH 7,6) sterilnih 10 ml syvorotkikrupnogo govedo. Medij mešamo, zlijemo vsterilnye cevi 4 - 5 ml, in iz njih v naklonnompolozhenii za poševno vsako serijo kotorogoproveryaetsya sterilnost. Več cevi so postavljeni v nočnem termostat. Pri kaljenje medija se zavrže vse posnet partiya.Probirki serumski agarja shranjeno pri 4sh C W2 nedel.MARTENOVSKY agar VODOYDVOYNOY KONTsENTRATsIIMartenovsky Meso pepton - 0,5 l, meso voda - 0,5 l, agar -agar - 15 g ocetne - natrijev kislina - 5 g, maltoza - 3 G.15 g agarja izperemo sredi delovnega protochnoyvodoprovodnoy v vodi, osušimo in previdno prenesemo v 1 lmartenovskogo brozge (0,5 l metalurškega peptona in 0,5 l myasnoyvody). Prilagojena pH 7.8 - 8.0 z naalkaljanje bulona20% raztopino NaOH na papir z krezolni rdečega indikatorja, ki je v tej reakciji obarva rumeno roza -malinovy. Brozgo smo refluktirali 10 minut. Nato 0,5% (5 g na 1 L) ocetna - natrijev kislina, 0,3% maltoze (3 g na 1 L), se pH pregledan in po potrebi ponovno naravnamo na 7,8 - 8,0, ogrevana . vtechenie 15 min, pustili stati na toplem (v vozilu Koch termostata) 2 - 3 ure in filtrirali skozi bombažne tkanine ali -marlevy filtra. Razdelimo v sterilne fiole (70 - 80 ml) pribolshom obremenitve in cevi (10 ml) in sterilizuyutodnokratno priteka para 30 min.Martenovsky peptonSvinye želodcev, prednostno seznanjen elastične stene, velike količine sluzi in simptomov prehladnih brez očistimo otzhira (želodcev impregnirani žolčne zavržemo), reši iizmelchayut mlinček. Nastalo mleto želodcu objavljen vbutyli zmogljivost 3 - 5 litrov in segrejemo do pour 50sh C vodoyiz glede na 1 liter vode 300-500 g zmletega mase. Tam zhedobavlyayut 1% kemično čista klorovodikova kislina (specifična teža 1.19). Masa dobro premešamo in čaka na termostat, bodisi na 15 -18 ur (ali več) na 37sh C- ali, če je otdelnogotermostata 42sh C, 18 ure (ali več). Med protsessaperevarivaniyabutyl stresali pri prvi pogosteje (po 1 do 1,5 ure), nato pa manj pogosto. Dobro razgradili pepton butylilezhit majhen spodnji sloj drobnih temnih osadka.Polnotu usedanja balastnih proteinov lahko preveri putemdobavleniya s 5 ml filtrirane peptona 1 - 2 kapljici 10% NaOH, motnosti ne sme poyavlyatsya.Deystvie encim ustavimo s segrevanjem v vodni kopeli, postopno vzpostavitev temperature do 80sh C popokazaniyu določena s termometrom potopljen v steklenici perevarom.Nagrevanie nadaljevali 10 min. V ta namen je naprava mozhnoispolzovat Koch ali avtoklavu. Tschatelnovzbaltyvayut steklenice, zaprte z bombažno - gazo s bumazhnymkolpachkom zamaškom in čaka na hladnem in suhem mestu za otstaivaniyapri temperaturi, ki ni višja 12sh C pepton uporabni neranee kot 7 dni, ko dobro usede suspendiramo chastitsy.Neobhodimo dodamo 20 ml kloroforma 1 l peptona dlyakonservirovaniya in zapri steklenico z gumijastim zamaškom. To videpepton mogoče shraniti brez sterilizacije pri sobni temperature.Myasnaya vodaDlya kuhanje mesa vode dvojni koncentraciji zhelatelnoispolzovat svežega mesa mlade živali upitannosti.Obezzhirennoe mediju osvobojen meso kite opravili cherezmyasorubku, nalijemo vodo na 1 liter vode na 1 kg mletega iostavlyayut preko noči pri 4sh C, zmes segrevamo pri jutranjem asbestovoysetke za 15 - 20 minut. od trenutka vrenja. Pripravljen otvarfiltruyut, mleto prepustna, se dobljeno meso zlijemo vsterilnye plastenka za vodo 250 - 500 ml in steriliziramo parom3 tekočina zaporednih dni do 30 min. Shranjeni pri 4sh kazalca C.Bumazhki kresol krasnyy0,1 g kresol rdečega raztopimo v 100 ml 95% alkohola pri temperaturi iostavlyayut 37sh C za 24 ur, pogosto s stresanjem. Dan dediščine je navlažena v rešitev filtrovalnoybumagi trakov in se hitro posuši. Bright - rumena barva pole iz schelochnoysrede koristi v različnih barvah krasnogo.SREDY ZA DOLOČITEV TSISTINAZNOY AKTIVNOSTISreda Pisa na OHF agareK 90 ml staljenega 1,5% agarja OHF (NI dovoljena uporaba Hottinger agar), pH 7,6, dobavlyayut2 ml 1% raztopine L -tsistina raztopino 0,1 N klorovodikove kisline (HCI), temeljito mešamo in isti volumen 0,1 N rastvoraNaOH za nevtralizacijo kisline. Kisle in bazične raztopine dolzhnybyt medsebojno titered, ispolzovatfiksanaly se lahko izdela s kemijskimi promyshlennosti.Sredu sterilizirane pri 112sh C 30 minut, shranjenih 1 mesec pri 4sh C.Agar s cistinom tali pri 90 SH C (medij ne zavre -. Dlyasohraneniya cistin). K ohlajeni medij dodanega 45sh C1 ML10 raztopino% svinčevega acetata in 9 ml goveda seruma krupnogorogatogo aseptično in ustekleničeno poprobirkam.Neobhodimo ugotavljajo, da ko temperatura 50sh C in višje, v prisotnosti svinčevega acetata in serumski motna sredapriobretaet mlečna barva. Težko je račun, ki temelji Pisa rezultatovreaktsii.Sreda poslovna okolja AGVDlya Pisa kuhanje medij je lahko na voljo na sestavo komercialne isbalansirovannuyu AGV srednje uporablja vbakteriologicheskoy praksi bi določili chuvstvitelnostimikroorganizmov na antibiotike. Stehtan del suhem okolju AgV vkolichestve 2,7 g uvedemo v 90 ml destilirane vode in segrejemo doee popolne raztopitve. Pripravimo 5% natriya.Dlya raztopino hidrogenkarbonat raztopimo 0,5 g NaHCOs v 10 ml destilirane raztopine vody.Zatem dodamo 0,1 g L-cisteina in segrevamo do polnogorastvoreniya cistina. Potem 2 ml vrele alkalijske rastvoratsistina uvedemo v 90 ml staljenega medija AGV, naravnamo pH in steriliziramo pri do7,6 112sh C za 10 minut. Za staljeni iohlazhdennoy 45sh do C do zaporedoma dodamo: 10 mlsyvorotki govedo, 1 ml 10% rastvorauksusnokislogo svinca, sveže pripravljene 1,5 ml sterilne 10% raztopino natrijevega tiosulfata in zlijemo v probirkam.Rastvory svinčevega acetata in natrijevega tiosulfata gotovyatextempore uporabo sterilne epruvete in destilirano vodo steriliziramo s strujanjem paro ali v vodni kopeli pri 30 min.Danny variantsredy Pisa otsutstviiMartenovskogo uporabljenega v agarju. Odnakoneobhodimouchityvat, chtodifferentsialno - diagnostični lastnosti tega okolja comparisonwith mediju, pripravljene na agarju OHF manj vyrazheny.SREDY ZA DOLOČANJE ureaze AKTIVNOSTIProbu ureaze se lahko dajo v dveh izvedbah: metoda Sachse Iput inokulacijo brozge s mochevinoy.Prigotovlenie opredeleniyaureaznoy reagentov za aktivnost pri čemer postopek ZakseGotovyat reagent 2 - A in V.Reaktiv A: sečnina 2% etil alkohola g96 2 mlDistillirovannaya 4 mlReaktiv voda B: 0,2% raztopina fenolrot 1 mlOdnozameschenny kalijev fosfat (KH PO) 0,1 R2 4Dv substituiran kalijev fosfat (K HPO) 0,1 gHlorid natrijev (NaCl) 2 40,5 gDistillirovannaya voda100 mlReaktiv A ni steriliziramo in shranimo pri 4sh C.Reaktiv avtoklaviramo Tekoči parom.Bulon mochevinoyK s 100 ml sterilne mesa - ali pepton Hottinger brozga (pH 7,0) smo dodali 1 g sečnine in 0,2 ml 1,6% alkohola rastvoraindikatora krezolrot. Vlijemo v 2 - 3 ml v sterilne epruvete s strujanjem pare sterilizirane 10 min.SREDA ZA DOLOČANJE saccharolytic AKTIVNOSTIDlya določajo saccharolytic aktivnost rekomenduetsyaispolzovat medij 1% pepton vode.K 100 ml vroče destilirane vode dodamo 1 g peptona, 0.5 g kemično čisti NaCl in 1 ml indikator Andrede.Ustanavlivayut pH 7,4, kuhamo 5 minut., filtriramo skozi filtrirni papir ilipolotnyany je prilagojena tako, da prvotni volumen goryacheydistillirovannoy vodo. K temu dodamo eno podlaga izuglevodov saharozo, glukozo (1 g), škrob (0,5 g) ima pomisleke zlijemo v epruvete v 2 - 3 ml in steriliziramo tekuchimparom 3 dni do 30 min. ali 0,5 atm. 30 min. Gotovyesredy indikator Andred so brezbarvne ali rahlo rozovatyyottenok.Indikator AndredePosuda za pripravo kazalnik mora biti suha, kemično čisti, z tleh probkoy.K 100 ml destilirane vode dodamo 0,5 g kisline fuksinai 16,4 ml 4-odstotno raztopino NaOH. Rešitev za dan ostavlyayutpri 37sh C, občasno tresenje, dva dni hranijo nasvete in nato odstrani v temnem prostoru. Sveže pripravljena rastvorimeet slame - rumene ali rahlo roza odtenek, kotoryyischezaet med skladiščenjem. Ko intenzivno - roza okraskerastvora med kuhanjem indikatorja mora dobavitesche dodamo 1,6 ml 4-odstotno raztopino NaOH.SREDA ZA DOLOČANJE nitrat reduktaze AKTIVNOSTIK 100 ml hranilna brozga (BCH ali Hottinger brozge) pH 7,3 - 7,5, brez nitritov (prijava Grissaili Kasatkina reagent) dodamo 0,1 g prostega nitratakaliya nitrita (kno). Preveri enkrat nitrita vsebnost PO32 ml in dozirali na kemično čisto, suho epruveto. Gojišče smo sterilizirali 15 min.pri 120sh C.Reaktiv GrissaRastvor 1: 0,8% sulfanilne kisline v 5N ocetni kislote.Rastvor 2: 0,6% alfa-dimetil-5N uksusnoykislote.Pered naftalamin pri opravljanju Reakcijska zmes enakih volumnov raztopin 1 in 2. reagent primeren za uporabo za 15 minut, brezbarvna pripoyavlenii roza obarvanje -. neuporaben. Rešitve 1 in 2 hranyatpri 4sh C 2 mes.Reaktiv KasatkinaRastvor 1: 0,1% raztopina v destilirani rivanola vode.Rastvor 2: 12% raztopino klorovodikove kisline (HCI) .Prior izvedel Reakcijska zmes enakih volumnov raztopin 1 in 2. Reagent goden za uporabo v 15 min. Rešitve 1 in 2hranyat pri 4sh C 2 mes.RETsEPTY KRASOK1. Alkalni metilen modro Lefflera.Distillirovannaya ML1 99% vodno raztopino kalijevega hidroksida (KOH) raztopini 1 ML10% alkohola metilensko modrega 30 mlSmeshat. Obarva 1 - 2 Min.2. Ocetna siniy.Toluidinovy ​​toluidin modro gLedyanaya ocetna kislota2 0,5 ml96% etil alkohola 5 100 mlSmeshat mlDistillirovannaya vode. Obarva 3 - 5 Min.3. Kristal vijoličnim fioletovyy.Kristallichesky R5 0,25% raztopina ocetne kisline 100 mlSmeshat. Filtriramo. Stain za 5 - 7 min.METODY NADZOR hranilo SREDBakteriologicheskomu kontrolni predmet pervichnogoposevamateriala medij in medij za določitev strupenih, saccharolytic in biokemijskih lastnosti. Ko je proizvodnja sredvazhnym navora začetni krmilni medij nasoderzhanie amin baze azota.METOD kvantitativno določitev metode AMINO AZOTAPrintsip temelji na blokira formaldehida pH7,0 prostih aminov in alkalijske titracijskih ekvivalentnogokolichestva karboksilnih skupin. Začetek in konec titrovaniyaopredelyayut potentsiometricheski.Reaktivy: 1. Natrijev hidroksid (NaOH) 0,1N rastvor.2. Klorovodikovo kislino (HCl) 0,1N rastvor.4. Formalin (40% raztopina formaldehida). Pred kazhdymopredeleniem potrebno, da bi pH na formalin 7,0.Hod opredeleniyaDlya analizira določeno količino tekočega vzorca. Dlyazhidkih hidrolizati z nizko stopnjo prebave (0,1 - 0,2% aminske dušika) - 3 ml-s povprečno stopnjo razpok (0,3 -0,6% amin oksida) - 1 ml-z visoko stopnjo razpok (0,7 -1,3% amin oksid) - 0,5 ml-tekoče gojišče (0,08% -0,04 amin dušika) - 3 ml-tekoče ekstrakte (0,02 -0,04% aminoksida) - 10 ml.V čašo 50 ml testnega vzorca in da obseg dovodyatobschy destilirane vode do 20 ml. Elektrodypotentsiometra potopljena v preskusno raztopino in pHrastvora naravnamo na 7,0 z 0,1N NaOH 0,1N rastvoraHCl ali raztopine. Nato dodamo 2 ml nevtralne formalina in mešali ne da bi odstranili elektrod, vsebina vzorec se titrira s 0,1Nrastvora NaOH na pH 9,1. Pri titraciji treba ispolzovatmikrobyuretku 5 ml.Soderzhanie amino dušika v vzorcu v% (X) se izračuna po formuli: A X K x 1,4 x 100X = ----------------- , gdeB x 1000A - število 0,1N NaOH raztopine v ml, ki se je do titrovanieissleduemoy vzorca k - popravka na titer 0,1N NaOH, 1,4 raztopina - količina aminske dušika v mg, kar je enakovredno 1 ml NaOH-100 0,1Nrastvora - pretvorbeni faktor pri kraji-B - količina tekočega vzorca v mililitrih odvzet za analizo, 1000 - koeficient pretvorbe mg g.METOD BAKTERIOLOŠKO NADZOR hranilo SREDV praktične laboratorijem zhdaya serijo gojišča, zlasti pri uporabi novih baz (ililaboratornogo industrijski proizvodnji) in novih sestavin podlezhitbakteriologicheskomu nadzor zaradi njihove možne nestandartnosti.1. Nadzor kakovosti medijev za sejanje primarnega issleduemogomateriala določen z določitvijo: a) kaljivosti celic Corynebacterium cepivom proti davici, b) Čas za nastanek kolonij) ingibiruyuscheyaktivnostiv spoštovati soputstvuyuscheymikroflory.S, ki se uporabljajo za ta namen nadzorni toksigenske ilisvezhevydelennye toksigene kulture Corynebacterium davici stipichnymi kulturno - Morfološke lastnosti shtammzolotistogo aureus (музейный или свежевыделенный).Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка,вы ращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическимраствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. LA Тарасевича(условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходныхвзвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовятпоследовательные разведения вфизиологическомрастворе(см. схему).СХЕМАПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КУЛЬТУРЫ КОРИНЕБАКТЕРИЙДИФТЕРИИ И СТАФИЛОКОККА+-----+-----------+---------------------------+------------------+| N | Кол-во | Объем вносимой | Условное кол-во ||про- | физиол. | суспензии, мл | микр. клеток ||бирки| р-ра, мл | | в 1 мл взвеси |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 8 || 1 |1,0| 1,0 из исходной взвеси| 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 7 || 2 |4,5| 0,5 из 1-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 6 || 3 |4,5| 0,5 из 2-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 5 || 4 |4,5| 0,5 из 3-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 4 || 5 |4,5| 0,5 из 4-й пробирки | 5 x 10 |+-----+-----------+---------------------------+------------------+| | | | 3 || 6 |4,5| 0,5 
Zdieľať na sociálnych sieťach: 

 
Príbuzný