GuruHealthInfo.com

Medicinsko pravo: pravo, dokumente, odgovornosti, pravila, akti.




zdravstvena zakonodaja


Moskva, Zvezni center za državne sanitarnih in Epidemiološki Ministrstvo za zdravje 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 april 2000 godaData julij 2000 vvedeniya1 goda2.3.2. Živila in DOBAVKIMEDIKO hrane - Biološko ovrednotenje živilskih proizvodov, pridobljenih iz gensko MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Razvil inštitut za prehrano (Tutelian VA -Head, Aksyuk IN, Vasiljev AV, Vorobyev LS, VysotskiyV.G., Volgarev MN, Korolev AA, Kravchenko L . .V, Maganova NB, Mazo VK, Pokrovskaya GR, Sokol'nikov AA, Sorokin EY, TyshkoN.V) -. cepiva in serume inštitut. II Mechnikov Medical Sciences (Semenov BF, Britsina MV, Zakharova NS.) - (. GG Onishchenko, Petukhov AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Department of sanitarna inšpekcija) - Moskva Medical Academy. IM SechenovaMinzdrava Rusija (sodov NP, Sukhanov bp.) - Center"Biotehnika" RAS (Skryabin KG, Kuznetsov BB, Dorokhov DB, Asadov UE.) - Medical - Genetski center OVNIH (Shishkin SS.) - Moskovska državna univerza Applied biotehnologiiMinisterstva splošnega in poklicnega izobraževanja RossiyskoyFederatsii (Rogov IA, strašnični NG Gurova N., vozlov VV.). 2. Odobren 20. apr 2000, sprejet Glavnymgosudarstvennym sanitarne zdravnika Ruske federacije z dne 1. julija 2000g.3. Vpervye.1 predstavil. Splošne določbe in področje primeneniya1.1. Metodološke smernice določajo trebovaniyakprovedeniyu medicinskih - biološke raziskave prehrambenih izdelkov, pridobljenih iz gensko spremenjene istochnikov.1.2. Smernice so namenjene uchrezhdeniysanitarno - Epidemiološka služba Ruske federacije, ki izvajajo državno sanitarnih - epidemiologicheskiynadzor, kot tudi druge institucije akreditiran naprovedenie delo na tem oblasti.1.3. Zahteve te metodološke ukazaniyahv za izdelke, pridobljene iz gensko modifitsirovannyhistochnikov uporabljajo v fazi proizvodnje, higienski pregled, registracijo država, javna naročila, uvoz v državo in realizatsii.1.4. Metodološke smernice so namenjene za obespecheniyaedinogo, znanosti - pristop, ki temelji na ocenjevanju kakovosti ibezopasnosti živilske izdelke, pridobljene iz geneticheskimodifitsirovannyh virov, razvojne faze, pregledu registracija igosudarstvennoy produktsii.1.5. Proizvajalec novih prehrambenih izdelkov, pridobljenih izgeneticheski spremenjeni viri namenjeni dlyarealizatsii na ozemlju Ruske federacije je treba izdati eemarkirovannoy v skladu z ustaljeno poryadkom.2. Normative ssylki2.1. zvezni zakon "Na sanitarno - epidemiologicheskomblagopoluchii prebivalstva" z dne 30. marca 1999 o D.2.2. "Osnove zakonodaje Ruske federacije na državljane ohranezdorovya" z dne 22. julija 1993 g.2.3. zvezni zakon "O spremembah in dopolnitvah Ruske federacije vZakon "varstvo potrošnikov" in KodeksRSFSR o prekrških" 9. januarja 1996 D.2.4. Uredba o državnem sanitarni in epidemiološki uredbe, ki jo Ruske federacije PostanovleniemPravitelstva odobril 5. junija 1994 N 625.2.5. Predpisi o državni sanitarne in epidemiološke službe Ruske federacije, utverzhdennoePostanovleniem ruska vlada z dne 30. julija 1998. N 680.2.6. Resolucija Chief State Sanitarna vrachaRossiyskoy Federation N 7 od 6. aprila 1999, "O vrednotenju poryadkegigienicheskoy in registracijo proizvodnje hrane, poluchennoyiz gensko spremenjenih virov"0,3. Pogoji in opredeleniyaPischevaya - Hrana za surovine, produktyi hrana komponenty.Prodovolstvennoe njihove surovine - predmete bioloških, organskih in anorganskih izvora za dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy prehrambenih izdelkov -produktzhivotnogo, rastlinskega, mineralnega ali biosintezne izvora, prednaznachennyydlya človeško porabo, po obsegu in vpererabotannom vide.Komponent - žival snov, zelenjave, mikrobna ilimineralnogo izvor in p rirodnye sintezirovannyepischevye ali aditivi uporabijo pri pripravi ali proizvodstvepischevogo izdelku ali pa so prisotni v končnem izdelku v iskhodnomili vide.Kachestvo spremenjena živila - niz značilnosti, ki določajo lastnosti potrošnikov, kakovost hrane ibezopasnost produktsii.Bezopasnost prehrambenih izdelkov - ni nevarnosti dlyazhizni in zdravje prisotna in prihodnost pokoleniy.Gennaya Inženiring - oddelek za molekularno genetiko, povezanih ustvarjanje stselenapravlennym v vit0ro novi com Inácio geneticheskogomateriala (rekombinantna DNA) lahko reproducirajo celično ifunktsionirovaniyu - hozyaine.Geneticheski spremenjen organizem - neskolkoorganizmov ali organizma, vsak noncellular, enocelični ali mnogokletochnyeobrazovaniya sposobna kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo genskega materiala drugačno prirodnyhorganizmov dobljenim z genetskimi metodami inženiringa isoderzhaschie genski - inženiring materiala, vključno geni, njihovi fragmenti ali kombinacija genov.4. Postopek za higiensko ekspertizyi državno registracijo živilskih proizvodov, pridobljenih iz gensko modifitsirovannyhistochnikov4.1. Vsi prehrambeni proizvodi, pridobljeni iz virov geneticheskimodifitsirovannyh prelazov poryadke.4.2 higiensko pregledu Trenutno nameščeni. Izvajanje higienske pregled gosudarstvennoyregistratsii in živilskih proizvodov, pripravljenih iz geneticheskimodifitsirovannyh virov se izvaja po sporyadkom, Ruska federacija nastavite Resolution Glavni gosudarstvennogosanitarnogo zdravnika iz 7. 06/04/99 N "O vrednotenju poryadkegigienicheskoy in registracijo proizvodnje hrane, poluchennoyiz gensko spremenjenih virov".4.3. Organizacije, podjetja so v središču sanitarno-epidemiološki normalizacije, higiensko potrjevanje iekspertizy ministrstva za zdravje dokumentov in materialov Ruski Federatsiikomplekt, vključno z: - vlogo (dopis), da izvede higienski registracija ocena igosudarstvennoy živil izhaja izgeneticheski spremenjen istochnikov-- materiali, ki odražajo medicinski - genetski pischevoyproduktsii ocena pridobljena iz gensko spremenjenih istochnikov-- materialov, ki odražajo tehnološki skie pischevoyproduktsii lastnosti, pridobljen iz gensko spremenjenih istochnikov-- materialov, ki odražajo zdravstveno - biološka vrednotenja pischevoyproduktsii, pridobljene iz gensko spremenjene istochnikov.4.4. Obseg in program dela za ocenjevanje kakovosti ibezopasnosti živilskih proizvodov, ki izvirajo iz geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov ga rezultatamekspertizy določi predstavila materialov.4.5. Delo na oceno kakovosti in bezopasnostipischevyh izdelkov, pridobljenih iz gensko modifitsirovannyhistochnikov, podjetje - proizvajalec zagotavlja vzorce izdelkov, vkolichestve potrebno dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6. Na podlagi izpitov, če imaterialov dokumentov in rezultatov zdravstveno na - genetskih, tehnološke in medicinske - biološke raziskave produktsiitsentr sanitarno - epidemioloških norm, gigienicheskoysertifikatsii in znanje Rusko ministrstvo za zdravje pripravlja blankregistratsionnogo certifikat (ali obrazloženo mnenje obotkaze) in ga pošlje v podpis oddelka gossanepidnadzoraMinzdrava Rusije. Potrdilo o registraciji podpisyvaetsyaGlavnym stanje sanitarno zdravnik Ruske federacije, odsotnost AB - Chief State sanitarni in epidemiološki ministrstva, namestnik glavnega gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Medicinsko - genetsko ocenjevanje živil izvira iz gensko modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost izvajati kakršne koli raziskave na dannomurazdelu za vsako posamezno vrsto hrane, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov določi strokovni center "Biotehnika" Ruske akademije znanosti. Tehnike, opisane v točkah 5.1 - 5.3 morajo priprovedenii zdravniško - se priporočajo genetsko vrednotenje prehrambenih izdelkov, pridobljenih iz gensko spremenjenih istochnikov- metod, predstavljenih v točki 5.4, kakdopolnitelnye.5.1. RAPD genotipovNeobhodimoe analiza oprema in reaktivyOborudovanie in prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye Tip Eppendorf cevi in ​​1,5 ml 0,5 (na voljo v DNK-ASE-RNA ASE podjetja alfa) teflonskim batom in / ali stekleno palčko pod razmermikrotsentrifuzhnoy cevi 1,5 ml *>Tip Tabela mikrofuge Eppendorf (THETA 20 200000ob. / min.) *>Samodejna glasnost mikropipeto spremenljivka (klasični / študent ,5-10.000 L 10 mkl- 5 - - 40 mkl- 200) za konice Mikropipete (vrh "mikro" in konvencionalne) Hladilnik (vzorec hladilnik) *>Plavajoča Tripod - "splav" probirokVesy mikrocentrifuge 0,5 kgMikroanklav - "pritisk štedilnik"BidistillyatorDNK-ciklerja ("Amplituda-4") Elektroforetsko oprema ločitev DNKv fragmentov z elektroforezo v agaroznem gelu: vir napetosti za elektroforezo (NPC 300) *> in napravo za horizontalno mini - elektroforeza (mini kamero) *>UV osvetlitev za vizualizacijo rezultatov DNK elektroforezo (transilluminator - UVT) *>Tip SLR "zenith" Tip oranžna svetofiltromFotoplenka "Mikrat-200"(termostat"Temo 24-15") Stresalnik (3D) tip Mikrovstryahivatel cevi Vortex (THETA 2 ali 4) *>RN-metrFitotron gojenje (Phytotron-99) Tabela laminarni škatla (BL-1) ------------------------------- - *> Imenovanje izdelkov, ki so proizvedeni v podjetju"Biokom", Moskva, Rossiya.Neobhodimye reagenti in rastvoryReaktivyTris (hidroksimetil) aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy alkohol 96% agaroznem za elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor za pomnoževanje DNA (Biomaster - SRL - Italija - Rusije, Moskva) Priprava glavni rastvorov1 M Tris pH 7,5 . Raztopimo 121.1 g TRIS v 800 ml vody.Dovesti pH na želeno vrednost z dodatkom kontsentrirovannoyHCl in dopolnimo do 1 litra. Raztopino prosterilizovat.0,5 M EDTA pH 8,0. V 186.1 g EDTA dodamo 800 ml vody.Dovesti pH na 8,0 NaOH.5 M NaCl (stopnja reagenta ali analitskimi). 29,22 g NaCl raztopljenega v 80 ml vode in dopolnimo do 100 ml, prosterilizovat.10 odstotni SDS. Raztopimo 10 g SDS pri 90 ml vode, chtobyuskorit raztapljanju, lahko raztopino segrejemo na 60 ° C. C. DovestipH do 7,2 z dodatkom nekaj kapljic koncentrirane HCl idovesti do 100 ml. Opozorilo! Pri tehtanju SDS litsomasku dal naprej, saj v stik s sluznico nazofarinksa etotletuchy prahu je zelo razdrazhenie.Ekstraktsionny pufra (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA, 0,5 odstotka SDS). Za pripravo 100 mlekstraktsionnogo pufer zahteva 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5 ml M NaCl, 5 ml 0,5 M EDTA in 5 ml 10 odstotkov SDS. Raztopino segrejemo do 100 vodoyobem ml.5 M kalijevim acetatom. 49,1 g kalijevega acetata raztopimo v 80 ml vode, da skupni volumen do 100 ml.70 odstotkov etanola. Za pripravo 100 ml rastvoratrebuetsya 73 ml 96% etanola in 27 ml vody.TVE 5X pufra (0.089 M tris - osnove bornayakislota 0,089 m, 0,002 M EDTA pH 8.0). Za 1 liter raztopine zahteva 54 gTris, 27,5 g borove kisline (analitično čisti), 4,6 g Na2EDTAx2H20. Dlyaprigotovleniya elektrode 0,5X TBE pufer stokovyybufer moramo razredčiti 10-krat z destilirano vodoy.Bufer za nanašanje vzorca-6x (0,25-bromfenolovyysiny odstotka, 30-odstotni glicerol, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 g pufra zahteva 2,5 mgbromfenolovogo modro, 3 g glicerola, 0,1 ml Tris, 0,02 ml, 0,5 MEDTA pH 8,0.Rastvor etidijev bromid (10 mg / ml). Raztopimo 1 gbromistogo etidijev 100 mL vode. Za vizualizacijo DNA v raztopini agaroznomgele uporabimo v koncentraciji od 5 ug / ml. Opozorilo! Vsemanipulyatsii z etidijevim bromidom in raztopine DNA za izvedbo vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya iz rastlinskega tkiva proizvodnjo rastlinskih semen, gomoljev ali drugoyrastitelny materiala vzklile pod nadzorovanimi pogoji dopolucheniya svežih listov ali rastlinskega tkani.Vysechku stanja dobljenih z zapiranjem pokrova tipaEppendorf cevi 1,5 ml ali 10-14 mg tkiva (ko vysechkupoluchit depresijo) v400mlekstraktsionnogo intenzivno homogenizirane pufra (potrebne rešitve in reagentov) z pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. Za izolacijo DNA, je bolje, da mladih listov smyagkimi tkiva brez vidnih sledov uničenja. Teflon pestikdolzhen držijo stene cevi. Poskusite maksimalnominimizirovat čas homogenizacijski. Homogenizacija svinca dointensivnogo obarvanje zeleno ekstrakcije bufera.Probirki z Homogenizat Shake za 5 sekund. na Vortex.Pomestit ultrathermostat cevi in ​​inkubiramo pri 65grad. C 15 min., Vsebino občasno premešamo probirkimyagkim pokachivaniem.Dobavit v epruvete s 200 ul 5 M kalijevim acetatom (predhodno ohlajeno v hladilniku) z vsebino epruvete in tschatelnoperemeshat svetlobe vstryahivaniem.Inkubirovat vzorca v ledeni kopeli 15 min.Tsentrifugirovat vzorca v namiznem centrifugi pri 16.000 g 20min. pri sobni temperature.Ostorozhno izbiro 400 p.l supernatanta na sveže cevi iosadit dveh volumnov 96-odstotnega etanola (hlajeno) z rahlim mešanjem. Na tej točki, lahko opazujemo obrazovaniemalenkoy "meduze" ali fino dispergirani suspenzije. Pusti probirkina tabela 5 min.Tsentrifugirovat vzorcev na Stacionarna centrifugirajo pri 16.000 g, 10min. pri sobni popijejo temperature.Osadok DNK ohlajeno na -20 ° C. C-70 protsentnymetanolom in centrifugirali, kot je opisano v prejšnjem punkte.Rekomenduem Postopek ponavljamo enkrat raz.Slit supernatanta in uporabo mikropipetkimaksimalno odstranjevanje tekočih ostanke DNA probirki.Osadki suhe z odpiranjem pokrova probirok.Primechanie. Poskrbite, da ne overdry obarjanje DNA, DNA t.k.peresyhanie vodi do slabe topnosti v vode.Rastvorit DNA v 100 l je sterilna destilirani koncentracija ideionizirovannoy vody.Izmerit DNK.Amplifikatsiya genomsko DNKAmplifikatsiyu genomsko DNA izvedemo v 25 ul reakcijske mešanice (67 mM Tris-HCl pH-8,8-16 mM (NH4) 2SO4- 2 mM MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 mM vsakega dNTP- 10:00 / ml 25 praymera- mkggenomnoy DNA in 0,5 enot. Taq polimerazo) . Vse sestavine, razen DNA v kompletu za pomnoževanje Biomaster.Sterilnye firme Eppendorf tipa cev 0,5 ml in objavljen vshtativ podpisat.V eno od epruvet, da nastane reaktsionnuyusmes zaporedno dodajanje sestavin, kot je navedeno v pripravo reakcijske zmesi primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Sestavine | V enem vzorcu, l | Na 7 vzorcev l | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | Reakcijsko pufer brez | | || MgCl2 (10X) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | MgCl2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | zmes dNTP`s | 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | grundiranje (4 AU / ml) | 0,5 | 3,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | termostabilno DNA-polimerazo | 0.2 | 1,4 || (4 U / ml) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | DNK | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- reakcijsko zmes razredčimo v zadevnih cevi probirkam.Vnesti genomske DNA in previdno odpipetirali dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo olje (približno 17 p.l) dajanje odstranitev zračnih mehurčkov cevi vtechenie sekundami centrifugirali v stacionarna centrifugo in stand perenestiproby DNK.Ustanovit termostat in vodijo naslednje programa pomnoževanje DNA: 1 cikel: 94 ° C. C - 3 Minimalne 36 ° C. C - 1,5 Minimalne 72 ° C. C- 1,5 Minimalne II.33 cikli: 94 ° C. C - 0,3 Minimalne 36 ° C. C - 72 ° 1,5min.-. C - 1,5 Minimalne III - 1 cikel: 94 ° C. C - 0,3 min.-36 ° C. C - 1,5 Minimalne 72 ° C. C - 10 min.Primechanie. Zaradi uporabe velikih chuvstvitelnostiRAPD analizarekomenduem samo en termostat in tolkoodnim izbran set reagentov za pomnoževanje DNA. Vsereaktivy za pomnoževanje in DNA pripravkih morajo biti shranjeni vmorozilnoy komoro pri 20 ° C. C. refreezing (pod -20 grad.C) pripravo termostabilno rezultatov DNK polimeraze pri izgubi eeaktivnosti.Elektroforez agaroznem gelu in vizualizacijo produktovamplifikatsiiDlya Priprava 2 odstotka agaroze treba dodati 1 gagarozy 0,5X TBE pufru za 50 mL in dobro premešamo. bučo zaprt folgoy.Kolbu agarozo dal v mini-avtoklav ali lonec iavtoklavirovat je 15 min.Rasplavlennuyu agarozo ohladimo na 50 stopinj. C in vlijemo vpodgotovlennuyu gel plesen, preprečujejo nastanek mehurčkov vgele. Debelina gel mora biti 0,5 - 0,7 sm.Cherez 30 -. 40 minut, ko se tvori gel, odstrani grebenkui prenese na elektroforezo komoro, predvaritelnozapolnennuyu TBE pufer 0,5X. Gel popolnoma pokrytbuferom 1-2 mm.K 2 ul pufra dodamo 10-13 l reaktsionnoysmesi izdelki pomnoževanja, ki vsebuje DNA peremeshatpipetirovaniem in previdno je bil uporabljen za vdolbinico agaroznem gelu. V skrajni lunkunanesti molekularni marker massy.Primechanie. Značilno je, da je molekulska dvojno podajo massyispolzuyut lambda fagne DNA obdelali z restrikcijsko encimsko Hind v III ali Pst I iEcoR I.Elektroforez izvedemo pri 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny dokler ne doseže nivoja 1 cm od roba gela. Značilno elektroforezdlitsya 3-3,5 chasa.Dlya vizualizacijo pomnožili DNA fragmente gelpomeschayut v raztopini etidijev bromid (5 mg / ml) in provodyatokrashivanie 20 minut. na kachalke.Primechanie. Z raztopino etidijevim bromidom in vodijo v obarvanega gelemneobhodimo perchatkah.Chtoby zmanjša ozadje fluorescenca povzroča bromistymetidiem, je gel dvakrat izperemo z destilirano vodo pripostoyannom pokachivanii.Primechanie. Podaljšano pranje gela lahko povzroči kischeznoveniyu šibkih območjih ter erozija spektre ustrezno diffuzii.Gel dane na transilluminator filtru in pogled vprohodyaschem UV svetlobo skozi zaščitni zaslon in posebno zaschitnyeochki. Po potrebi RAPD spektri oranzhevyyili fotografirali skozi rdečo filtra na vrsto folije "Mikrat". Fragmentyamplifitsirovannoy DNK po zdravljenju z etidijevim bromidom pod UV budutflyuorestsirovat oranžno tsvetom.Primery uporabo analize RAPD za identifikatsiigenotipov kartofelyaV papir 19 se uporablja decameric začetnih oligonukleotidov. krompir Spektryamplifitsirovannoy DNA imeli veliko kolichestvofragmentov različne dolžine. RAPD analiza spektri stopnje kartofelyas uporabljajo premaz PTA-19 je pokazala pomembne vrste polimorfizmmezhdu (sl. 1) *>. Pridobljeni podatki kažejo nekaj variabilnost osuschestvennoy sort intravariety starinnyhotechestvennyh. Uporaba chislapraymerov omejena na različne razrede pridobiva RAPD spektre spetsifichnyedlya ločen razred. Analiza spektrov dovoljuje DNK vyyavitneznachitelnye razlike tesno povezanih razredov čeprav so techto proizvaja kot somaklonske variante ene in primerov BTEX identifikacija analitičnih zheroditeley.Osnovannaya DNA lahko uporabimo, kadar sorte ni mogoče zanesljivo ločiti porezultatam proteina elektroforeza, vključno z analizo vsehstadiyah času razvoja rastlin. razvili hiter način za izolacijo DNA iz glazkovkartofelya in RAPD tehniki za pomoč zmanjša čas in stoimostanaliza. Identifikacija po sortah preiskavah DNA lahko sdelanamenee od 24 ch.Kontrol somatskih spremembe v genom in se razmnožujejo invit0ro transformiranih krompir pod enakimi primerji dokazalvysokuyu učinkovitost analizo DNA pri ugotavljanju genotipovrasteny (sl. 2) *>.-------------------------------- *> Risbe niso privodyatsya.Zaklyuchenie. Predlagani micromethod izolacijo genomske DNA izrastitelnogo material za RAPD analizo je hitra, ekonomičen, saj ne zahteva drage opreme ireaktivov primerjavi z drugimi molekulskimi metodami otsenkirastitelnyh genotipov in tudi preprosta za uporabo. Rastitelnyymaterial se lahko jemlje kot iz polja rastlinjaku in gojena vlaboratornyh pogoji. To ne zahteva micromethod bolshihkolichestv rastlinsko tkivo (1-20 mg), ki je bolshimpreimuschestvom v primerjavi z drugimi metodami, saj obrata za nadaljnjo pozvolyaetsohranit raboty.Perechislennyedostoinstva S to metodo je zelo prikladno pri delu z velikim številom vzorcev za analizo mase in tudi priizuchenii posamezni genotipi rasteniy.5.2. Ugotavljanje, ali opredeleniyanalichiyachuzherodnogo Transgenska DNKv končnih izdelkov pitaniyaStandartno sprejete metode genskega materiala in analizo izdelki yavlyayutsyaimmunologichesky in identifikacijo transgene DNK na pomoschipolimeraznoy verižne reakcije (PCR). Ta študija pischevyhproduktov, izdelani izhodiščni selskohozyaystvennoesyre toplotno obdelati, lahko dobimo immunologicheskiyanaliz nestabilno in slabo vosproizvodimyerezultaty kot so denaturirani proteini pogosto ne sposobnyvstupat posebne reakcije s protitelesi proti nativnega belku.Polimerazno - verižna reakcija v tem smislu je tempreimuschestvom da toplotna obdelava surovine ne vpliva nakachestvo DNK kot predlogo in zato vsebujejo produktahpitaniya in polfinalu maks preostali DNK surovina priprovedenii PCR daje enake rezultate kot nativna merilo DNK.Vtorym izbrati PCR kot metoda za analizo občutljivosti yavlyaetsyavysokaya preseglo vsaj dvaporyadka metodov.Pomimo znane imunološki občutljivost PCR je veliko cenejša in boleestabilnym Postopek od drugih analiznih metod. Odnimnemalovazhnym Druga prednost PCR je, da sintetični oligonukleotidi uporabljeni vreaktsii če se pravilno vyboremogut uporabljajo za analize različnih transgenov, da v primeru imunoloških metod nevozmozhno.Metody ugotavljanje, ali transgenska DNKv Končni prehrambenih izdelkov s pomočjo polimeraznoytsepnoy reaktsiiVydelenie produktaV DNA iz izbran preskusna metoda dodeljevanja DNK odločilno vlogo igraetsoderzhanie olja v prehrambenih izdelkih. S povečano soderzhaniimasla (čokolada, rafinirano rastlinsko olje, itd) Dodatne ekstrakciji suspenzijo nepolyarnyhrastvoriteley z vodo. To omogoča prenos DNA, ki vsebuje vpischevom izdelek v vodni fazi, v katerem čiščenje proizvoditsyadalneyshaya. Za končno tehnike čiščenja ispolzuetsyaoriginalnaya razvil v središču "Biotehnika"Običajno je dolžina fragmenta PCR pri ugotavljanju transgene DNK neprevyshaet 1000 baznih parov, vendar nizhesleduyuschihmetodik bila osnova za postopke izolacije in čiščenja s poluchitdostatochno čiste pripravke DNK za PCR. Vtorymkriteriem tehnike vzorčenja je bila zahteva, da se zmanjša čas, porabljen za dodelitev enega DNK.Metodika1 droge. 0,5 g vzorca s hrano homogeniziramo s teflonskim batom ali pomoschisteklyannogo v 0,5 ml pufra A (100 mMt0ris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCI, 10 mM beta-merkaptoetanola) 0,2. Po homogenizaciji, 100, ul 20% SDS. Smestschatelno zmešali in inkubirali 20 - 30 minut. pri 65 stopinjah. C.3. Ohladimo na 4 ° C. C, dodamo 0,3 ml 5 M kalijevega acetata, mešamo z vrtinčenjem in centrifugirali 10 minut. pri 15000ob. / min. v mikrofugirani pri sobni temperature.4. K supernatantu dodamo 1 ml Wizard smole MaxiPreps (Promega, ZDA) in zmes inkubiramo 10 minut. pri 25 stopinjah. C.5. Nato dobljeno zmes črpamo preko mini kolonkuWizard (Promega, ZDA), sprali z 2 ml 80 odstotkov izopropanol, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem v mikrofugirani (15.000 obr. / Min., 2 min.). 6. Mikro-dodamo v 50 ul destilirane vode segrete na 65 ° C. C.7. Inkubiramo Mini - steber vode 10 minut. pri 65 stopinjah. C iotzhimayut raztopine DNA v čisto sterilno mikrotsentrifuzhnuyuprobirku centrifugiranjem v mikrocentrifuge (15.000 vrtljajev / min za 2 min ...) glede na vsebnost DNA določeno živilo skladiščenju enoto polimeraze -. Verižna reakcija volumen 50mkl zahteva od 2 do 20 ul nastalo priprava DNK.Obraztsy hrane s povečano vsebnostjo olja peredvydeleniem DNA se podvržemo dodatnim ekstraktsiiemulsiey kloroformu vode.Dlya 0,5 g produkta homogeniziramo smesi0,5 ml pufer A in 0.5 ml klorofila jarem 20 in Homogenat smo inkubirali min.pri 56 ° C. C. Nato jo ohladimo na 4 °. C tsentrifugiruyut10 min. pri 15.000 vrt./min. / min. v mikrofugirani pri sobni temperature.Vodnuyu faze zberemo in prenesemo v čisto epruveto. Daleeprodolzhayut iz koraka 2 metodiki.Vybor gornjih primerji za PTsRDlya natančno določanje prisotnosti transgene DNK, da je zagotavljanje družba zagotavlja informacije molekulyarnoystrukture transgen vložek, namreč njeno nukleotidnayaposledovatelnost. Ta zahteva je predstavil canwas natančno določiti prisotnosti določenih geneticheskoykonstruktsii. V tem primeru bo sintetični oligonukleotidi se sintetiziramo s PCR dlyaprovedeniya da vyyavitfakt prisotnost transgena, ki kodira regijo. Dolžina prianalize posebne primerji bi morale biti vsaj 25 parnukleotidov, da se prepreči nastanek kot posledica reakcijskih produktov PTsRnespetsificheskih primerov, kjer se nemozhet zastopane take informacije za nekaj razlogov (npr podjetje - procesor moč proizvoditelproduktov le proizvodimogodrugoy organizacija transgeni surovin ) provoditproverku potrebujejo prisotnost izločenega izdelkov testiranih DNKnabora standardni ekspresijskih kaset znamke vm rovoypraktike za proizvodnjo transgenih rastlin. Tistim otnosyatsyapraymery identificirati gene selektivno markerski rezistentni (neomicin odpornost gen NPT II in higromicin HPH), atakzhe standardno uporabljene območja promotorja (E35S promotor virusatsvetnoy zelje, itd) .Vybor pogojih analize PTsRDlya po standardnih primerjev v svetu ispolzuyutobscheprinyatye pogoji PTsR.Dlya primeri specifičnih primerjev pogoji izbirnih provedeniyaPTsR se izvede za vsak primer otdelno.Apparatura uporablja v PCR Analiza eerezultatovAnaliz prisotnost transgena inserta DNA vsebuje vproduktah napajanje poteka na termostat DNA "VP-4"izdelani "Biocom"Moskva. Kaljenje obraztsovosuschestvlyaetsya na suhih termostatov "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskva. Za PCR Taq izdelan ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskva. Analizproduktov PCR smo izvedli z uporabo restrikcijski analizi etihproduktov z elektroforezo v agaroznem gelu in dobljeno vzorec na posleduyuschegofotografirovaniya transilluminator podjetju UVTIproizvodstva "Biocom"Moskva, na filmu "Mikrat -Izopan" uporabo fotoaparata "zenith" ali v digitalni obliki pripomoschi digitalni fotoaparat "Kodak DC 120".Fotootpechatki ali odtisi, ki na laserski tiskalnik z ločljivostjo najmanj 600 pik na palec, je treba priložiti kprotokolu za ispytaniy.5.3. PCR identifikacija blizkorodstvennyhshtammov bakteriyV prisotne tehnike molekularne biologije temeljijo naprimenenii verižne reakcije s polimerazo (PCR), so vsi boleeshirokoe uporabo v diagnostične namene in izražanje - analizaraznoobraznogo biološkega materiala. Intenzivne metode razvitiepodobnyh zaradi zelo visoke občutljivosti PCR, možnost hitrih rezultatov (v odnogorabochego na dan), nizki stroški dobljenih rezultatov (v primerjavi z drugimi metodami) in predelovalne (vozmozhnostyuorganizatsii sedanja delovna skupina praktično lyubyhusloviyah do mobilnega izrecnih - laboratorij) .DRUGE molekulska - biološke metode ali zahtevajo dlyasvoey realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih laboratorije ali zagotavljajo zmanjšanje ultaty z nizkoydostovernostyu.Tipichny primer nezmožnosti dostovernoyidentifikatsii - filogenetske analize sorodne vrste ponukleotidnoy 16SpPHK sekvenco gena. Takšna analizyavlyaetsya običajen za celotno opisa novo odkrite vidovbaktery vendar daje nizko zanesljivost popytkerazlichit tesno povezane vrste, kot se pojavi v industrijskih sevih sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy B.anthracis.Metod bacile in bakterije identifikacijo uporabo PTsRVybor metodaSredi temelji na uporabi PCR molekulska - študije biologicheskihmetodov biodiverziteta najprimernejša za tseleyidentifikatsii bakterije je metoda ti DAF-PCR, ki ga Caetano razvila - Annoles (Caetan O - Annoles G Bassam Kot J, Gresshoff PM (1991) pomnoževanje DNA odvzem uporabo veryshort arbit0rary oligonukleotidnih primerjev, Bio / Technology 9: 553 -556) .. Kot tudi druge metode, ki so bodisi zahtevajo slishkomobshirnoy informacijo o strukturi genoma posameznega organizma (direktno detekcijo seva - specifičnih genov), ali pa nepolnuyudlya identifikacijo podatkov sorodne vrste (RAPD-PCR, DALP-PCR), ali preveč zapleteno in drago, in ne morejo bytrekomendovany za široko uporabo (AFLP-PCR) .Edinstvennym ozko grlo v DAF-PCR je izbor primerne dlyatochnoy prepoznavanje kratkega oligonukleotidnega praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "Biotehnika" RAS programmnoeobespechenie za nukleotidno sekvenco analiza polnyhgenomnyh bakterij dovoljuje izbiro oligonukleotidnyhpraymerov za DAF-PCR, določa identifikatsiyubaktery zaupanja na ravni sevov, ki ustreza individualnymrazlichiyam za ljudi in druge višjih evkariontih. Takšna rabotaprovedena za identifikacijo tesno povezane bakterijske skupine. anthracis, za katere identifikacija uporabo standartnyhmetodov (filogenetske analize nukleotidnega posledovatelnostigena 16SpPHK) je bezuspeshnoy.Vybor pogoji PTsRUsloviya reakcije določi stopnjo rezultatov z natančnostjo ivosproizvodimosti in jih je treba sredstva za konkretnoygruppy bakteriy.Sozdanie elektronske baze dannyhDlya popolno in zanesljivo prepoznavanje specifičnih mikroorganizmaneobhodimo ustvarjajo elektronsko zbirko podatkov o določeni gruppebaktery, ki vključuje podatke o največ WHO mozhnomchisle različne voljo kot čiste kulture ali sevov kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee zanesljive rezultate v PCR dobimo vydelennayaneposredstvenno DNA pred usmerjanje reakcijo zamorozhennoybakterialnoy lepljenje z uporabo Promega firme smolo (ZDA) s kontaktnimi pomodifitsirovannomu metodo in Birnoboyma razmerju: - 20 - 40 ul odtajanega Bakterijske 100mkl mase suspendiramo v pufru I (50 mM t0ris HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 50 MKG / ml RNaze) dodamo .K suspenzijo 120 xl liznega pufra (0.2 M NaOH, 1% SDS) in pričakujemo bakterijske lizo gledano vzpenjajoči Visco stisuspenzii. Zatem bakterijske proteine ​​in zapletena oblomkovkletochnoy stena oborimo z dodatkom 100 xl 2,55 M acetat kaliyapri močnim stresanjem na vrtinec za 5 min. Zhestkoevstryahivanie zvrtinčen treba porvatdlinnuyu bakterijske DNA, ki so vezani na membrano vneskolkih točk, sicer spada osadokvmeste s SDS-proteinskega kompleksa. Zmes smo nato centrifugirali namikrofuge za 5 - 10 minut. Supernatant smo prenesli v mikrofugirani za mlprobirku 1,5, ki vsebuje 0,75 ml smole "Čarovnik PCR Prep"ali "Čarovnik Mini Prep" Družba Promega. Zmes temeljito peremeshivayuti črpamo skozi mini-kolono, smo smolo izperemo oborino vmini stolpec 2 ml 80% izopropanola, centrifugirali v mikrofuge 1 minuto. pri največji hitrosti za odstranjevanje ostanka tekočine iminikolonku damo v sterilno 1,5 ml mikrocentrifugirko, ki se uporablja v majhnih - stolpec 50 l sterilne destilirani vodi in segrevamo ilideionizovannoy kolonsko cev 5 min. ko 70grad. C. Nato mini - stolpec v cevi se nahaja v mikrofugirani 1 minuto itsentrifugiruyut. pri največji hitrosti za perenosarastvora DNK v epruveti. Opisan postopek, ki je reda velikosti 5 mkgDNK. Velikost dobljenega DNA - od 3 do 15 kb, za ločevanje, ki vpolnedostatochno 16S RNA bakterij (okoli 1500 bp priispolzovanii primerski par 11F / 1492R). Pod pogojem ispolzovaniyasterilnyh raztopine in posoda dobljeno DNA lahko shranimo pri + 4 ° C. C za šest mesecev. Rok priprave DNA pri 20 °. C presega 2 goda.Ispolzuemye reagente in oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"VP-4"izdelani "Biocom"Moskva. Kaljenje obraztsovosuschestvlyaetsya na suhih termostatov "Thermo 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Moskva. Za PCR Taq izdelan ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Moskva. Analizproduktov PCR smo izvedli z uporabo restrikcijski analizi etihproduktov z elektroforezo v agaroznem gelu in dobljeno vzorec na posleduyuschegofotografirovaniya transilluminator podjetju UVT1proizvodstva "Biocom"Moskva, na filmu "Mikrat -"Izopan" uporabo fotoaparata "zenith" ali v digitalni obliki pripomoschi digitalni fotoaparat "Kodak DC 120". Iliottiski fotografskih odtisov narejene z ločljivostjo laserski tiskalnik ni menee600 dpi, je treba uporabiti za provedeniyaispytany protokol. Oligonukleotidnih primerjev smo sintetizirali v centru"Biotehnika" RAN.5.4. Metode za določanje celotne svoystvgeneticheskoy vstavki5.4.1. Izolacija genomske DNA verižno reakcijo s polimerazo in ravnanja. Za izolacijo genomske DNA iz vzorca izdelka mozhetprimenyatsya fenola na - kloroform ali drugo primerno metodo [124]. Dobljene pripravki DNA shranimo pri minus 70 °. C iispolzuyutsya za analizo verižni reakciji s polimerazo (DRP). Oligonukleotidne primerje za PCR lahko predostavlenyfirmoy - proizvajalca izdelkov ali pa jih lahko sintetiziramo v skladu z pozakazu podatki vstavki.5.4.2 strukturo. Pri izvajanju PCR z uporabo Taq DNA-polimerazaproizvodstva IBCh. V volumna Značilni eksperimentih polimerizatsionnuyusmes 50 ul je izdelana tako, da je vsebovala 350 nggenomnoy DNA, vsaka od chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov 1,5 mm (firme izpusta Fermentas Litva), 1 enoto. Taq polimerazo. Nato k zmesi polimerizacijski dodamo 30pkM par oligonukleotidnih primerjev v rastvoresleduyuschego pufru sestavka: 67 mM Tris-HCl pufru (pH 8,0 pri 25 ° C), ki vsebujejo 16,6 mM amonijev sulfat, 67 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanola, 6 , 7 mM EDTA in goveji serumski albumin vkontsentratsii 170 mcg / ml. Nato smo vsak vzorec nanesemo na 50mkl mineralnem olju in reakcijsko zmes izvede v skladu s programom, posebej prilagojenih za mestno specifično gen DNA termostat vmnogokanalnom "Termtsik" proizvodnja JSC"tehnologija DNA" (Moskva) .Če potrebi mogoče izvesti multipla PCR dlyaanaliza več pomembno vstavki.Produkty pomnoževanja fragmente smo analizirali z elektroforezo vplastine 6 odstotkov poliakrilamidnem gelu (2,5 h pri 200 V) DNA-markerjev je standarden nabor fragmentov DNA plazmidypBR322 dobljenih pod akcija restrikcijsko encimsko Alu 1 (trdne MBIFermentas). Obarvanje fragmentov DNA izvedemo z etidijevim bromidom. Analiza rezultatov in fotografiranje elektroforegrammyosuschestvlyayut v usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. metode vrednotenja vstavki5.5.1 operacijo. Določitev mRNA, ki jih povzročajo vstavljanja, je rastlina genoma kotorayavvedena s pomočjo ugnezdeni PTsR.Vydelenie skupno mRNA pripravke iz vzorcev produktaguanidin - tiocianat - fenol - Postopek kloroform [125] iprovedenie nadaljnje gnezda PCR primerje z navedeno [126, 125]. Dokaz sintetizirano cDNA vpoliakrilamidnom gelsko elektroforezo z barvanjem z etidijevim bromidom [126] .5.5.2. Dvodimenzionalne elektroforetsko analizo belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie reagenti: akrilamid, metilen bisakrilamida, agarozo, tris, glicin, natrijev dodecil sulfat, amonijev persulfat, Triton X-100, ditiotrietol amberlita MB-1,2-merkaptoetanola, Coomassie briljantno modro R-250, modra kumassibrilliantovy G-250, Tween-20, 4-kloro-l-naftola, bychiysyvorotochny albumin - podjetja "Serva" (Nemčija) - Tween 20 - podjetja"Merk" (Nemčija) ampholines pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, podjetja"LKB" (Švedska) .V kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: nitro - podjetja "Schleicher in Schull"(Nemčija) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov ekstrakte pripravimo podobno z uporabo obespecheniyamaksimalnoy solubiliziranje proteinov liza raztopino (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih sredstva - urea merkaptoetanola (ditiotrietola) in Triton X-100. LR - 9 Mmocheviny raztopino, ki vsebuje 5% 2-merkaptoetanol, 2% Triton X-100, 2% ampholines 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala ureo raztopimo vdeionizovannoy vode in nadalje očistili z dodatkom AmberlitMV-1. Po 10 min. Inkubacijska Amberlite rastvorumocheviny ločili in dodali Triton X-100, ditiotrietol (ali 2-merkaptoetanol), ampholines pH 3 - 10 do ekstrakcijo omenjenega proteini kontsentratsiy.Pri vzorce tkiva smo mleto s škarjami ineskolko roki z mrzlo fiziološko raztopino kuhinjske soli. Zatemizmelchennuyu Tkivo homogeniziramo v steklenim homogenizatorjem steflonovym VP batom pri razmerju 100 mg v 2 ml tkivnega LR itsentrifugiruyut pri 700 g 10 minut. Supernatant frakcija, ki vsebuje solubiliziran beljakovine (odlomek) smo uporabili dlyadalneyshey raboty.Dlya analiza proteinov z uporabo dvodimenzionalne elektroforeze poO`Farrellu - metoda, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom gel v prisotnosti SDS [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie izvede v steklenih ceveh dlinoy150 mm in notranji premer 3,5 mm. Tube prilagoditi vshtativ, nižji lukenj zaprti in folija zalivayutpolimerizatsionnoy Zmes parafilmom. Za sestavljanje polimerizacijo smesigotovyat naslednjih reagentov: 1.1. 30 odstotkov akrilamid, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Triton X-100.1.3. 10 odstotkov persulfat ammoniya.1.4. Anoda pufer za izoelektričnega fokusiranja: 0,01 Mfosfornaya kislota.1.5. Katoda pufer za izoelektrično fokusiranje: 0.02 M NaOH.1.6. Zaščitna raztopina: 4,5 M sečnine raztopino, ki vsebuje 1% Triton X-100-2,5% merkaptoetanola, 1% ampholines pH 3,5 - 10.1.7. Prenesljive pufra za gelsko prvi smeri - belkovyybufer (.. glej poglavje 2.2) Raztopino 1.1- 1,2-1,6-1,7 shranili pri 4 ° C. Con za 2 - 3 tedne. Drugi uporabljajo svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 ml polimerizacije zmesi zahteva dlyazapolneniya cevi 12, izvedemo z mešanjem 12 g sečnine, 6,75ml destilirane vode, 3 mL 1,1 ml 2,25 rastvoraTritona X-100 (20%). To zmes smo obdelali z ionsko izmenjavo smoloyamberlit MB-1 V, odfiltriramo in jo dodamo 225 p.l amfolinovpH 3,5 - 10 in 900 p, l ampholines pH 5 - 7. Zmes smo degazirali, nato zlijemo v aneposredstvenno cevi, na katero dodamo 22,5 in 32,5 mklTEMED l 10-odstotno raztopino PSA.Polimerizatsionnuyu zmes uvedemo v cev z brizgalko, zapolnyayatrubki od spodaj navzgor na enaki ravni za 2 - 3 cm pod verhnegokraya (gel višina stolpca 11 cm). Vrh zaprtje vodu.Posle večplastna polimerizacija gela vode v njegovi poverhnostyuudalyayut cevi in ​​damo v komori gelelektroforeticheskuyu"Bio-Rad"Model 175 (ZDA). V spodnji komori nalivayutrastvor katoda rezervoarjem pufru. Vzorci cevi za analizo se uporablja vobeme 50 - 150 ul (100 xg proteina). pol variantefraktsionirovaniya uporabljena količina Vzorec se poveča na 250 - 350mkl. Iz zgoraj, robovi cevi sta plastna zaščitna raztopina 1,7 iverhnyuyu Naprava anodna komora napolnjena s ravnotežna buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii izvedemo izhajajoč iz 400 V do 200 V.ch, in nato pri napryazhenii1000 V do 5400 V.ch vsota vrednosti ali (noč način) V 210 prinapryazhenii dvajset ur in nato eno uro 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya da se izvede pri napetosti, ki sega od 400 V.ch SAR 200, in nato pri 1000V V.ch znašal znacheniya1000 - 2500 V.ch .Po konec izoel Gel stolpec ktrofokusirovaniya prepojen B5 prenosljiva ml pufra (raztopina 1,7) 10 minut. ko komnatnoytemperature. Nato so geli niso namenjeni nemedlennogofraktsionirovaniya v drugi smeri ihranyat hitro zamrznili pri -20 ° C. C do več nedel.Dlya drugi frakcionirni napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny Laemmli metodo [130] v ploščah z gradientom PAAG7,5 - 25% v SDS.Dlya prisotnosti ta namen pripravimo naslednje raztopine, katere zatemsostavlyayut polimerizacijski zmesi, da se tvori plošče stran: 2.1. 60 odstotkov akrilamid, 0,8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. Za ločilnega gela pufru: 1 M Tris-HCl (pH 8,8) .2.3. Pufer za zlaganja gela: 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) .2.4. 10 odstotkov dodecil natriya.2.5. 10 odstotkov persulfat ammoniya.2.6. Elektroda pufer za elektroforezo: 0,025 M Tris glicin 0,192M, 0,1 odstotka SDS (pH 8,3) .2.7. Agaroznem gelu: 1% raztopina agarozni z dobavleniem0,125 2,6% Bromophenol modro. Po kuhanju rastvorneobhodimo kuhamo 5 minut., Preden kazhdymispolzovaniem gelu mora rastopit.Rastvor 2,5 pripravimo tik pred uporabo, preostanek smo shranili pri 4 ° C. Druga smer C.Fraktsionirovanie izvedemo vplastinah Velikost strani 160 x 160 x 1 mm z linearnim akrilamida gradientomkontsentratsii 7,5 - 25%, v napravi za vertikalnogoelektroforeza. Gel plošče pripravimo na standardni steklyannyhkassetah. PRIMER podrobno uporaba etogooborudovaniya predhodno objavljene [131] Konvencionalno, za tvorbo vzporednih plošč 6 gela koncentracija sgradientom akrilamid (ločimo gel) 2 Raztopino smo pripravili: luči (koncentracija AA 7,5%) in težka (AA25% koncentracija), 100 ml vsakega . Celotna struktura teh raztopin je podan vtablitse.TablitsaSOSTAVY ločimo in koncentriramo geli + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Komponente | ločevanje gel | Osredotočanje || + -------- + ------- + gel || | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60-0,8% ml | 41.8 | 12.5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1M t0rIS pH 8,8, ml | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 M t0rIS pH 6,8, ml | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% SDS, ml | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O, ml | 20.4 | 49.3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, l | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, l | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + Težka in enostavne rešitve so mešani uporabi smesitelGradient nekdanji model 395 ("Bio-Rad", ZDA) ali analogichnoeotechestvennoe naprave, tako da dobimo lineynyygradient koncentracije akrilamida v kasetah, ki postepennozapolnyayutsya uporabi peristaltične črpalke. Značilno je, da hkrati napolnjena plošč 6, kar zagotavlja visoko obnovljivosti identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov a. Po polnjenju v polimerizaciji smesnaslaivayut vodo. Polimerizacijo traja 30 - 40 minut. Zatemvodu odstranjena, površina gela so osušili s filtrirnim papirjem izalivayut raztopina, ki tvori zlaganje pripravo gel.Dlya 50 ml raztopine s poudarkom gelyaneobhodimo mešanica komponent, prikazanih v tabeli prichemkatalizatory (TEMED in PSA) dodamo direktno peredzalivkoy gela. Polimerizacijo zaključena v 30 - 40 min.Udaliv vode na površini zlaganje gelsko nakladyvayutgel prvo smer in da se ulita staljene agaroznem gelu (raztopina 2,7). Z roba vsake plošče tvorjen "žep" dlyananeseniya proteini - markerji. V 5 min. agarozni gelzatverdevaet, kar zagotavlja popolno stik s prvim gel napravleniyas gelsko ploščo, in damo v napravo za kaseto dlyaelektroforeza.Elektroforez izvedemo pri naslednjem načinu: jakost toka 30 mA na 200 Vmaksimalnaya plastinumaksimalnoe napetosti 50 Vt.Elektroforez končano, ko vodilni rob barvila dohoditdo nižji ločilnega gela .Po zaključku frakcionacijo za detekcijo proteinov nagelevyh ploščah z uporabo obarvanja s Coomassie R-250 in dušika -kislym serebrom.Okrashivanie beljakovin s Coomassie R-250 n oestriasis metoduFairbanks do [132] v raztopini 10 odstotkov ocetne kisline, 25-odstotni izopropanol 0,05 odstotka Coomassie R-250.Okrashivanie izvedemo v vodni kopeli 15 minut. sposleduyuschey pralni nevezano barvilo 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku dušik - srebro izvedemo v kislem Blum spremembo [133] z uporabo naslednje reagente: Raztopino natrijevega hyposulfite (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 g / l-raztopino dušika - kislina srebrov 200 ml - 0,4 g srebrovega -kislogo dušika, 150 l-formalin razvoju raztopina 200 ml: Na2CO3 - 8 g, 4 ml natrijevega rastvoragiposulfita, 100 ul formalina.Vse srebrenjem procesov ko izvedemo na stresalniku in vplastikovyh posodah. Gel po obarvanju s Coomassie R-250otmyvayut barve 10-odstotno ocetno kislino, da svetlogofona. Nato trikrat 20 min. inkubirali v 25-protsentnomizopropanole odstranitev Gel SDS, nakar promyvayutdistillirovannoy vodo (20 sek.). Nadalje, 1 minuto. gelinkubiruyut v hyposulfite raztopino in dvakrat za 20 sekund. otmyvayutv destilirano vodo. V naslednjem koraku je gel bodo vrastvore dušikom. - Sour srebro 15 minut, nato pa trikrat z 20sec. izperemo z destilirano vodoy.Na končna faza gela damo v raztopino v razvoju iokrashivanie ustavili z izpiranjem z vodo, gel kogdana več prikazani novih pyatna.Fotografirovanie geli, ki se izvajajo v mokrem stanju naplenku visoko občutljivostjo (npr Mikrat 300). Geli dlyahraneniya posušimo. V ta namen so bili dehidrirani v raztopini, ki vsebuje 3% glicerola in 50% etanola pri 30 min., Zatemplotno določen med dvema plastema celofan in sušimo pri sobni vnatyanutom temperature.5.5.3. Določitev ekspresijskega proizvoda vključen vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi mišje protiteles proti proteinu, ki ga kodira operacije odkrivanja vstavkoypolipeptida.Dlya proizvoda vstavkirekomenduetsya Uporaba konjugiranega proti mišjim imunoglobulina na"Sigma" pri razredčitvi 1: 1500 ali konjugata proti immunoglobulinovmyshi "Amersham" razredčimo 1: 600.Na prva stopnja analiza izvedena electrotransfer proteinov iz PAAGna nitrocelulozo filtra podjetju "Schleicher in Schull"(Nemčija) po metodi Towbin [135] z uporabo bufernogorastvora vsebuje 20 mM Tris, 0.192 M glicin, 20 protsentnyymetanol, 0,1% SDS (pH 8,3 - 8,4). Elektromigraciji se izvaja za vertikalna komora B electroblotting posebna podjetja"BioRad" (USA) (ali drugo podobno opremo) privelichine napetost 15-16 V in tok 120 - 160 mA techenienochi (12 - 14 ur) .Po okonchaniyaelektroperenosa nitroceluloza filtrpromyvayut v treh spremembah 0,01M PBS (natrijev - fosfatnem pufru, pH7 4) 5 za detektiranje min.Dlya prenese na membranski filter proteinov je v techenie5 - 10 min. inkubiramo v raztopini barvila (0,25% rdeče-c, 40% ocetne kisline, 15% metanola). Ozadje madež izperemo 0,01MPBS.Na zadnjo fazo pred vezavo monoklonalnyhantitel, smo zaostanek na filtru sprali v 0,1 M PBS, ki vsebuje 30% izopropanola (odstraniti SDS), 3 x 20 min., Nato petkrat 0,01 M 0,01MPBS in PBS-0,05% Tween-20. Sorbtsiyuantitel zatreti čim nespecifičen filter po inkubaciji v raztopini 1% BSA v 0,01MPBS 1 uro pri 37 ° C. C (ali preko noči pri 4 grad.C). Filter smo sprali z 0,01 M PBS petkrat, nato 0,1 M PBS-0,05% Tween 20 petkrat. Nazadnje je potekala v rastvoresootvetstvuyuschih protitelesa inkubacijsko v 0,1 M PBS (redčenje izbran vkazhdom primera). Po inkubaciji z mAb 0,1MPBS filtru speremo 5-krat in 5-krat 0,1 PBS-0,05% Tween-20 in inkubiramo z peroksidaznymkonyugatom proti miške Ig G 2 uri pri 37 ° C. C. Po pyatikratnyhpromyvok 0,1 M PBS in 0,1 M PBS-Tween-20 pufer dlyaokrashivaniya pour filter (12 mg 4-kloro-1-naftol raztopimo v 4 ml etanola, se volumen naravnamo na 20 ml z 0,1 M PBS in neposredno dodamo peredprimeneniem 12 p, l 30 odstotkov vodikovega peroksida) dokler ne nastane bistra manifestacije ivyderzhivayut zon.5.5.4 obarvajo. Otsenkabiologicheskiheffektov izdelka (ov) delovanje vstavki.5.5.4.1. Semipreparativno proteinske preparate razporeditev poslefraktsionirovaniya proteinske ekstrakte dvodimenzionalna elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh očiščen protein preparatovdvumernym summarnyebelkovyeekstrakty z elektroforezo v standardnih razmerah, opisanih zgoraj frakcionirali. Nato se detektsiyubelkovyh frakcije izvedemo v razmerah rastvoromatsetata kalija non-lociranje 4M. Podobno frakcije smo izrezali iz 20 - 40 in zbrano kosi gelevyhplastin geli pred izolacijo smo shranili pri -20 ° C. Lahko C.Nekotorye beljakovine z difuzijo eluirani. V etihsluchayah dobljenih kosov geli, ki vsebujejo protein z istim imenom, je razlog in homogenizirali v deionizirani vodi, nato eluiramo chegobelok za 15 - 20 minut. Homogenat gelyavstryahivaniem na magnetno mešalo. Po centrifugiranju vtechenie 20 min. pri 700 g, smo supernatant zbrali in postopek sosadkom ponovimo še dvakrat. Kombinirani Supernatant (obemokolo 50 ml) smo liofilizirali, oborino ponovno raztopimo v 1 - 2 mldeionizovannoy hladno vodo in dobimo relief natrijevega izbytkadodetsilsulfata. Otdelyayuttsentrifugirovaniem oborino (15 min. Pri 3000 g), ki obespechivaetponizhenie SDS koncentracija v supernatantu do 0,25% [134]. Potem otostatka soli in SDS razpolaga dialize proti distillirovannoyvody 12 ur pri 4 ° C. poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu proteini C.Neelyuiruyuschiesya neposredno izvaja v enoti za podjetja "Bio-Rad" (ZDA) ilianalogichnom oprema. Na prvi dializnoymembrany uporabo (priložen napravi) inkubiryut je vtechenie 30 min. v vmesnem pomnilniku elektroda za elektroforezo (rastvor2.6) pri temperaturi 60 ° C. C. Fragmenti soderzhaschieiskomuyu del gela damo v stekleno cev priključena sdializnoy membrane in napolnjena z elektrodo pufra dlyaelektroforeza. Cev je nameščen v napravi, zgornji in zlijemo nizhnyuyukameru pufer za elektroforezo, iprotsess povezane elektrode izvajajo preko noči pri konstantno jakostjo izrascheta 5 mA na cev in omejitvijo napetosti. Belokkontsentriruetsya v volumnu približno 400 p, l pufra rastvorsobirayut to smo membranski izperemo, in to raztopino dodamo odsek kosnovnoy. Raztopino proteina smo nato dializirali proteina s postopkom po Bradfordu izmeryayutkontsentratsiyu in liofiliziruyut.V dela za določitev razlichnyhrastvorah koncentracije proteina z uporabo metode Bradfordove [136]. Osnova metodalezhit veže barvilo Coomassie briljantno modra G-250 sbelkom analizaotbirayut rastvore.Dlya vzorcev (razredčen v sluchaeneobhodimosti), ki vsebuje 1 - 10 g proteina v 0,1 ml. 25 mklobraztsa dodali 25 litrov raztopine barvila, ki vsebuje 0,05% Coomassie briljantno modra G-250, 5% etanola, 10% ortofosfornoykisloty in absorbance pri 594 nm. Koncentracija Belkaopredelyayut iz umeritvene krivulje za rastvorabychego serumski albumin ("Serva".5.5.4.2). Testiranje biološke lastnosti celične kulture vložki produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya preveri biološke lastnosti izdelka funktsionirovaniyavstavki uporabljenega testa - sisteme, ki temeljijo na kulturi človeških fibroblastov postnatalnyhdiploidnyh dobljen kot je opisano predhodno [137] .Kultivirovanie celic izvedemo v DMEM mediju (izdelan s "PanEco", RF), dopolnjenem s 5% serum veliki rogatogoskota in 5% ljudi popkovna seruma popkovnične krvi (izdelan s "PanEco", Ruska federacija), ki uporabljajo bodisi steklene viale Carrel, ali plastikovyeodnorazovye trdne žimnice "Costar" (Nizozemska) ali v 96-lunochnyeplanshety podjetju "nunc" (Danska). Kot organsko krasiteleyprimenyayut vitalnega barvila, metilensko modrega [138] in krasitelGimza [139] (podjetje "Merck"Nemčija) .Na prvi fazi se določi v odvisnosti kolichestvomkletok med odprtino in intenzivnost obarvanja z metilen modrim, so dlyachego celice zasejali v različnih gostot pri 96 vdolbinami planshetyi kultiviramo 1 dan pri 37 ° C. C. Nato kletkiprizhiznenno obarvamo 1 uro z metilen modrim, dobro vkazhduyu dodatkom 25 ul raztopine barvila. Potem obarvali kletkidvazhdy speremo z vodo in posušimo na zraku. Izmerenieopticheskoy material, gostota luknja opravlja electrophotometer"EFOS 9305" (podjetje "EFOS", Rusija) pri 594 nm. Rezultati opredeleniyaopticheskoy gostoto in količino nasadijo na dobro kletokobrabatyvayut s pomočjo računalniškega programa "Sigmaplot" ilianalogichnyh računalnik programm.Pri preučevanje učinka operacijo vstavljanja izdelek naproliferativnuyu sposobnosti v človeških fibroblastov do celice rastejo pri 96 vdolbinami, dodamo drugo kolichestvapreparata proteina in po 4 dneh gojenja probyokrashivayut metilen modro, kot je opisano zgoraj. Vzporedno vseproby mikroskopiruyut (MBI-3 LOMO adaptirovannyykakinvertirovanny mikroskop s posebno šobo) dlyaotsenki morfološko stanje rastni kletok.Pered Giemsa suspenzijo obarvanje raznoyplotnosti celice v DMEM mediju z 10% fetalnega telečjega seruma vobeme 200 l, dodanega vdolbino plošče s 96 vdolbinami. Tako je pod nadzorom pervyyvertikalny število lukenj, ni zapolnyayutkletochnoy suspenzija. Plošče smo inkubirali v atmosferi 5 protsentnogouglekislogo plina pri temperaturi 37 ° C. C. Po en dan kletkifiksiruyut dodajanje vsako vdolbino 50, ul holodnogosvezheprigotovlennogo 2,5 odstotka glutaraldehid. Cherez30 minut. pritrditev na 4 °. C je bil odstranjen iz vrtine držala, lunkidvazhdy izperemo s hladnim Hankovo ​​raztopine in Giemsa mklkrasitelya zapolniti 100, ki se specifično veže na kromatina razredčimo 1:50 pred uporabo. Kletkiinkubiruyut barvilo 3 ure pri 37 °. Krasiteludalyayut C. Nato smo vdolbinice dvakrat izperemo z raztopino Hanks, napolnjena 100mkl eluiramo raztopine (0,1 M NaH2PO4: C2H5OH - 1: 1) iinkubiruyut pri sobni temperaturi 15 minut. ko nepreryvnomperemeshivanii. Merjenje absorbance pri čemer eluiramo na fotometer rastvoraprovodyat "EFOS 9305" pri valovni dolžini 620 nm.6. Vrednotenje živilskih proizvodov, poluchennoyiz gensko spremenjene vire funkcionalnega - tehnološki svoystvam6.1. Potreba po katerem koli raziskovalnem porazdelu 6 se določi strokovnjak moskovskega gosudarstvennogouniversiteta aplikativno biotehnologijo Ministrstva za šolstvo Ruske splošno iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Življenje človeka organizmaglavenstvuyuschuyu beljakovin igra vlogo, tako da se zdi vazhnymprosledit, če ne opravi nobene spremembe v protsessegeneticheskoy spremembe so mozhetprivesti genskega inženiringa za spremembo strukture in funkcije beljakovin, beljakovine chastnostifermentov.Svoystva nedvomno povezana z njeno strukturo. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza svojih kristalov. Vendar pa je za večino proteinov, ki se uporabljajo v prehranskih podatkov o svojih strukturepo več neznanih razlogov. Po drugi strani pa je znano, chtostruktura beljakovine določi tudi njihove termodinamične lastnosti, kar vplivajo njihove funkcionalne svoystva.Suschestvuet število meritev termodinamične metode, med katerimi je prednostna metoda je kalorimetrija. Etotmetod vam omogoča merjenje temperaturna odvisnost teploemkosti.Iz ​​dobimo odvisnost lahko izračunamo dlyanativnoy toplotne zmogljivosti in denaturirani oblike beljakovin in beljakovin temperaturudenaturatsii entalpijo. Izračunana termodinamični parametrypozvolyayut opredeliti sestavni hidrofobnost in konformatsionnuyustabilnost proteine ​​[38 - 40]. Te značilnosti tesnosvyazany z glavnimi funkcionalnih lastnosti [41 - 44] .Metod ione v pare HPLC vobraschennyh faze omogoča identifikacijo enoto zamenyaminokislotnyh ostanki v makromolekule beljakovin in nepogrešljiva študijskih prisravnitelnom proteinov [44] .V procesu spreminjanja genom organizma njej nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost dejavnikov vneshnimneblagopriyatnym - bolezni, žuželke - škodljivcev herbicid, itd V nekaterih koncentracijah, to komponentymogut nevarna za zdravje ljudi, ki se uporablja v pischuprodukty proizvedena z uporabo genskih metod inzhenerii.Poetomu med industrijsko predelavo surovin take mogutpotrebovatsya spremembe obstoječe tehnologije, obespechivayuschieminimalnoe preostala opasnyhdlyazdorovyakomponentov. Takšne spremembe v tehnologiji lahko vplivajo nakachestvennyh kazalnikov (funkcionalno -tehnologicheskihsvoystvah) protein pripravkov iz tega geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe spremembo sestave aminokislinsko proteinov, ekstrahiranih iz gensko spremenjenih prehrambenih izdelkov (npr ima uravnotežen ACN) za povečanje njihove pischevoytsennosti. To bo nedvomno pomenilo spremembe v funkcionalnih lastnosti komercialnih -technological pripravkov beljakovin iotrazitsya kakovosti živilskih izdelkov, v katerih oniispolzuyutsya. To pa lahko privede do sprememb v neobhodimostivneseniya procesov s pomočjo etipreparaty. Zato je neprekinjen nadzor (monitoring) lastnosti priprav protein, pridobljen iz surovine za živilo, ko geneticheskimodifitsirovannogo gotovo bezopasnomsoderzhanii komponente škodljiva cheloveka.Mikro- beljakovin in makromolekul določa ryadnaibolee pomembno funkcionalne lastnosti proteina, tako kakrastvorimost, sposobnost za stabiliziranje emulzij in pene form geli zadržijo maščobo in vlago [9 - 13] .Ti funkcionalne lastnosti neposredno povezana skharakteristikami Končni živilskih proizvodov. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | funkcionalne lastnosti | Vpliv na značilnosti končnega || | Izdelek | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | pH vodne suspenzije | lastnost proteina preparatov- || | Določa temeljna možnost || | Uporaba zdravila beljakovin v || | Posebna vrsta izdelka | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Topnost | se uporablja kot primarni pokaza- || | Od Tell-kakovostnih beljakovin preparatov- || | Povzroča reološke lastnosti || | Prehranskih sistemov, trajnostni, ki vsebujejo beljakovine || | Ness emulzije stabilizirana z Belgorod || | Com zhirouderzhivayuschuyu sposobnost belko- || | O pripravki | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | reološke lastnosti | določanje ravni dajanju zdravila || vodnih disperzij | proizvod, ki zagotavlja zahtevano || | Kompleksne reološke lastnosti dokončanega || | Izdelka vpliva na načine materiala || | Tokovi v procesu | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | zadrževanja vode in | vplivajo na stopnjo uvedbe izdelka || zhirouderzhivayuschaya | proteinske preparate zagotavljanje || zmogljivosti | zmanjšanje izgub v procesu || | Predelano (kuhano in ocvrto), enotna || | Usklajenost izdelkov, zmanjšanje v zakonu || | Rezultat ločevanje vode in maščobe, || | Izdelki za zmanjšanje glasnosti | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | kritična koncentracija | določa stopnjo uvedbe proizvoda || nega gela | pripravki proteinski || | Zahtevani kompleks strukturna - mehanska || | ICal lastnosti končnega izdelka | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | Emulzija | določa stopnjo uvedbe stabilnost produkta || | beljakovinski pripravki zagotavljajo || | Priprava stabilnih maščobnih emulzij, || | Prepreči ločevanje maščob v postopku || | Obdelava | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + trenutno ni standardiziran metodyopredeleniya funkcionalne lastnosti in rezultati meritev dolzhnynosit primerjalne narave v zvezi z drogami ilikommercheskim proizvode, proizvedene iz nemodifitsirovannogopischevogo metod syrya.Osnovnye za določitev funkcionalnega preparatovprivedeny lastnosti v naslednji tabeli. -------------------------- + ---------------- + -------- + ------------ + | indeks | Metoda za določanje | literarne || || vir | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | 1 | 2 | 3 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | sestavek identifikacijske | histološke metode | 51 || izdelki ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | Topnost | spektrofotometar | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | zadrževanje vode | Postopek centrifugiranja | 46 || sposobnost ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | stabilnost emulzije | Postopek centrifugiranja | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | kritična koncentracija | thermotropic Postopek | 48 || gel | gela + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC B- | Postopek centrifugiranja | 49 || NOSTA ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | podrejenega | mikrokalorimetrije | 38-40 || stabilnost ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | Identifikacija amino | združuje ione v pare metodo HPLC | 45 || ostanki ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | termodinamske lastnosti | razlika metoda | 39 || | skeniranja microcalorimeters ||| | Kalorimeter || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Integralna hidrofobnosti | mikrokalorimetrijo | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | reološke lastnosti | viskozimetrijo | 52 || vodne disperzije ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | sestavek amino kislina | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | organoleptične lastnosti | Qualimetry | 53 || maščobe: barva, vonj, preglednost |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | lomni količnik | REFRAKTOMETRIČNO | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | maščobe teža | Denzitometrija, | 53 || | Gravimetrija || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Viskoznost maščobe | viskozimetrijo | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | maščobno - kislina sestavek | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Jod številka | volumetrija | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | Kislinsko število | volumetrija | 53 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | število umiljenja | Volumetrija | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | temperatura želatinizacija | viskozimetrijo | 54 | | škrob ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | velikost škrobnih zrn | Optična mikroskopija | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | zadrževanje vode | Gravity | 54 || sposobnost škroba ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | reološke lastnosti | viskozimetrijo | 54 || vodne škrobna disperzije ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | oteklina škrob | Optična mikroskopija | 54 || zrna ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | kritična koncentracija | Postopek thermotropic | 54 || želirna škroba | želirni || + -------------------------- + -------------- ---------- + ------------ + | vsebnost amiloze in | spektrofotometer | 54 || amilopektinski ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. me 
Zdieľať na sociálnych sieťach: 

 
Príbuzný