Metode za laboratorijsko diagnostiko klamidioza v čeljustno sinusitis

Video: Otorinolaringolog Ponidelko SN (SM klinika)

I. Tsitoskopichesky Postopek detekcije Chlamydia

Predlagano dva načina, ki se lahko razdeli na invazivne in neinvazivne. POVZETEK Prvi je ta, da je material za študijo vsebina maksilarnih sinusov, zaradi česar preboda Kulikovskii igle, ki je bil po centrifugiranju, ki se uporablja za pripravo madežev.

Drugi način je, kot sledi: Po nosne anemizatsii 0,1% epinefrin raztopine in uporaba anestezije srednjem območju nosni prehod dikaina 3% raztopine - 0,3 ml, z uporabo posebne enkratno krtače opravljene ograja materiala v rotacijskih premiki med 10-15 medialni površina srednjega turbinate in stransko nosno steno v območju obnosnih votlin anastomozah. Tako dobljeni material se porazdeli enakomerno na steklu, posušimo na zraku in fiksiramo v acetonu 10 minut pri 4-6 ° C. Pripravljen brise je mogoče shraniti do študija za 2 tedna. pri temperaturi 2-6 ° C.

Slikarstvo na Romanovsky-Giemsa. Ex tempore barvilo razredčimo z destilirano vodo 1:10. Diapozitivi so bili dani v petrijevki lesene palice drog dol. Prostor med gibom in dnu skodelice je napolnjena z barvo. Barvanje se izvaja 45 minut. Potem steklo temeljito speremo s tekočo vodo, osušimo s filtrirnim papirjem, in razlikovati fermentiranih alkoholu (100 ml 96% etanola dodamo 10 kapljic ledoctu). Ko so pripravki za barvanje gledano v svetlobnim mikroskopom s potopno leče (X90). V tem primeru, celično citoplazmo obarvajo modro, jedra - v vijolično-modro citoplazemske vključkov klamidijo se določi kot temno modre ali roza mikrokolonije na modri podlagi citoplazmo. V prvem koraku so osnovne organi Chlamydia vključkov obarvajo rožnato korak začetnih celic v modri barvi (Ponidelko SN, 2001). Za povečanje informacijske vsebine morfološke študije postopek izvedemo v štetje števila nevtrofilcev, limfocitov in makrofagov v brisom pripravljene pred zdravljenjem in dinamiko pod vplivom drog upravlja.

II. Metoda neposrednega imunofluorescenco

Razmazan pripravljene iz soskobnyh materialov, kot tudi krvni madeži obarvamo z zmesjo sprejeti v delovnih razredčitvah polivalentni imunoglobulin fluorescentno klamidijo in goveji albumin, označene s rodamina za kontrastne barve. Uporaba delovno razredčino serumov 1 / 20-1 / 40. Drsi s testnega materiala in nameščen barvilo damo v vlažni komori v termostat za 30 minut, nakar se steklo odstraniti in temeljito izperemo s fosfatnim pufrom (pH 7,2) na magnetno mešalo 1 uro, spreminjanje pufer po 30 minutah. Na suhih brisa uporablja eno kapljico zastalega glicerola (9 ml glicerola in 1 ml fosfatnega pufra s soljo), nato pa so pokrita s pokrivnim steklom (Ponidelko SN, 2001). Priprave so brskanje po fluorescenčni mikroskop "LUMAM-OUT". Dobičkonosnost Analiza se izvaja vizualno. Rezultati se štejejo za pozitivne, če pri pripravi zaznal morfološko tipičnih klamidija elemente specifične fluorescentno smaragdno zeleno ali rumeno-zelena:

Chlamydia reticular celice (PT) in klamidije grozda v citoplazmo v obliki mikrokolonije, ki imajo obliko kompaktnih, površinsko obarvana formacijah različnih velikosti - od 0,25 do 1,5 um;
Klamidijo osnovnih teles (EBS) - tvorba, ki so večinoma izven celice, okrogla ali jajčaste oblike, ki ima izrazito obarvano venec v obliki zaprtega obroča ali semiring velikost 0,25-0,5 mm;
intercellularly nahaja vključenost - velike svetle zelene lise nastanejo so blizu drug drugemu ET.

III. serološke metode

volumen krvi v 2.5-3.0 ml v tešče, vzetih iz kubitalni vene v suho epruveto za centrifugiranje. Cev s krvjo, da bi bolje strdkov umiku krvne celice inkubirali pri 37 ° C 40-45 minut. Po inkubaciji se cev centrifugirali 20 min pri 3000 obr. / Min strdek "obkrožiti", in cev damo 1 uro v hladilniku, nato pa s pomočjo Pasteurjeve pipete, je serum ločen od oborine. Serume smo transportiramo v laboratorij v naslednjih 1,5-2 ure ali shranimo pri temperaturi 4-6 ° C za 1-3 dni. Posamezne vzorce seruma vsebuje dovoljeno v zamrzovalnik hladilnika pri temperaturi minus 20-40 ° C, dokler serijskih študij v obdobju, ki ne presega 6 mesecev.

Najbolj specifična in informativne (90%), se šteje, da je reakcija posredne imunofluorescence (RNIF). Dokaz protiteles proti klamidiji samo en vzorec seruma četudi je njihova zmogljivost titer 1 / 8-1 / 16 kažejo verjetnost tok kot klamidioza in prisotnost reakcijo v sledovih povezan s katero koli klamidijo bolezen etiologije migriral zadnji. Povečanje klamidijo protiteles 1 / 64-1 / 256 in še višje v enem vzorcu seruma pri sedanjih dolgih in kompliciranih oblik okužbe odraža nastane trajanja aktivnosti mikroorganizma humoralni odziv in ustreznih rezultatov kliničnih in epidemioloških analize in anamnestični podatki pridobivajo diagnostično vrednost.

Posredna imunofluorescenca tehnika omogoča identifikacijo klamidijo, da z ustreznimi preskusnimi predmeti in titracija serumov glede na posebne vrste sredstev, prav tako omogoča, da ocenijo vsebino serumov posameznih razredov imunoglobulinov v prisotnosti poslovna fluorescenčne Igu M, A, G. negativni rezultati seroloških testov ne izključuje prisotnosti akutnega ali kroničnega (trdovratnega) okužbe klamidijo (Ponidelko SN, 2001).

Uporaba RNIF maksilarni sinuzitis pri bolnikih določitev titer Chlamydia protiteles v serumu. Kot uporabljamo antigenske pripravke, pripravljene na razmaze meji stekelc mikrobioloških suspenzij, določenih za 30 minut z mrzlim acetonom. Material za suspenzije razmaza so mešanica hranilni mešiček piščančjih zarodkov ali organov belih miši, okuženih z C. trachomatis, C. pneumoniae in C. psittaci.

Te antigenski pripravki, ki imajo specifičnost na ravni rodu, poskrbi za identifikacijo Chlamydia protiteles (AT) epidemiološko pomembnih za vse vrste klamidijo. Preskus seruma v razredčitvi 1: 2 do 1: 256 se uporablja za brisi, steklo, objavljen v vlažni komori in inkubiramo pri 37 ° C 15-20 minut. Po izpostavitvi je preskusni material speremo z vodovodno vodo, potem smo steklo potopljena v skodelico akumulatorja s fosfatnim pufrom pH 7,2-7,4, in nato speremo z destilirano vodo. Po sušenju pri sobni temperaturi, da povzroči madežev sprejeti na redčenje kunčjega anti-humanega imunoglobulina luminescent in dajanje stekla v vlažni komori, inkubiramo pri 37 ° C 15-20 minut. Nato se barvanje zmes odstranimo, steklo izperemo s fosfatnim pufrom pH 7,2-7,4 10 minut, speremo z destilirano vodo in posušimo na zraku.

Mikroskopija obarvanih preparatov izvedemo z uporabo fluorescenčnem mikroskopu. Intenzivnost posebnega fluorescence v formulacijah je bila ocenjena s konvencionalnim chetyrehkrestovoy lestvico (Ponidelko SN, 2001):

"++++" - svetlo fluorescence smaragdno zelena okoli EBS jasno vidne svetlobne "platišča";

"+++" - dovolj svetla, fluorescenca rumeno-zelene barve, je mogoče zaznati obrobne "platišča" v ET;

"++" - šibka fluorescence patogen morfološko jasno pokazala, ampak periferne "obroči" v ET težko razpoznavno;

"+" - šibko fluorescenco, barvni nedefinirane morfologija mikroskopija nasprotuje razvidno slab.

Za diagnostično-znatno titer anti-klamidijo protitelesa vzeti največjo razredčitev seruma, ki zagotavlja posebno barvanje najmanj "++." Pri ocenjevanju sera serološki aktivnost proti klamidijo antigenov za sprejem diagnostično pomembnih titrov od 1: 8 in višje.

IV. Metoda verižne reakcije s polimerazo

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) smo najprej opisana v 1985 in je postal standardni postopek za pomnoževanje DNA v številnih laboratorijih za molekularno biologijo. Osnova tehnike Znamka oligonukleotidov odrejenih ponavljajoče cikluse sinteze DNA, ki vodi do replikacijo in vitro ciljni nukleotidnih sekvenc. Posledično lahko pomnoževanje pojavi 1 milijardo kopije ciljne DNK, ki se lahko ugotovi bodisi z gelsko elektroforezo ali s hibridizacijo s specifično sondo, ki mu sledi detekcijo hibridi z ELISA testom (ELISA). PCR ima visoko vrstno specifičnost in občutljivost na 10 molekul DNA (Ponidelko SN, 2001).

Po zbiranju materiala po zgoraj navedenih postopkih pri uporabi posebnih ščetke enkratno ga damo v sterilno epruvete, 2 ml (epindorfy) vnaprej pripravljene v (0,9% raztopina natrijevega klorida) s pufrom. Industrijska 2 uri in transportiramo v laboratorij po zamrznitvi do temperature minus 18 ° C vzdržujemo še dolgo Pred študijo.

Rezultat analize je pozitiven, če:

Velikost produkt DNA v kliničnem vzorcu natančno ustreza izdelku DNA kontrolnim vzorcem;
v vzorcu, ki vsebuje kliničnega vzorca in interni standard, ki je opredeljen z določenim izdelkom DNA internega standarda;
v vzorcu, ki vsebuje vodo (negativna kontrola) namesto kliničnega vzorca, se zazna proizvod DNK.

Rezultat analize se štejejo za negativne, če:

v vzorcu, ki vsebuje kliničnega vzorca, določenih izdelkov DNA ni mogoče zaznati;
PCR Rezultati v obeh kontrolnih vzorcev specifične DNA izdelki ne zazna.

Analiza ponovimo, če:

V vzorcu, ki obsega kontrolno DNK, ni mogoče zaznati izdelki DNA-specifična;
v vzorcu z notranjim standardne izdelke specifične DNA ni mogoče zaznati, in ki jih določen izdelek DNA odkrita v negativni kontroli.

V. Postopek kultura za izolacijo klamidijo

Izolacijo patogena v celičnih kulturah (cm), predhodno obdelamo z različnimi antimetaboliti, je eden izmed najboljših načinov za klamidijo diagnozo, tako imenovani "zlati standard".

Material je vzet kot neposredna metoda imunofluorescenčni (PIF) sterilnih posebne ščetke. Vzeto material se nahaja v transportnem gojišču. Kot prometno sredstvo je fosfatni pufer s saharozo, na katero je pred uporabo toplotno inaktiviran govejega seruma dodamo pri 4% parova, streptomicin 50 ug / ml amfotericin B 25 mg / ml medija. Dobava materiala v laboratoriju poteka (v termo z ledom) najpozneje v 2 urah po vzorčenju. Kulture izvedemo z uporabo celične kulture LLC + MR2 + L929 + BHK-21C umetno nizke upornosti. Prevzema material laminiran na plast celične kulture, ki rastejo na krovnih, predhodno prepustna gojišče. Nato je celična kultura okuženo objavljen v vialah in centrifugirali 1 uro pri 3000 obr. / Min, kar povečuje število znotrajceličnih vključkov. Po centrifugiranju se material zlijemo v fiole, dodamo izolacijskega medija «Needle» (Eaglas MEM) z tsiklogeksamidom pri koncentraciji 2 mg / ml. Epruvete smo inkubirali v termostatu pri 37 ° C za 48-72 ur (ustreza času cikla Chlamydia), potem smo krovnih odstranjeni iz enoplastni s cevmi, ki se nahaja na steklene ploščice tla monosloja v kanadskem balzama in določanje patogenov inkluzijski. Pred tem je fiksacija in barvanje izvaja razmaže flyuorestsiiruyuschimi protiteles in rezultate ocenili po 48-72 urah po PIF (s pomočjo posebne poliklonalnih in monoklonska protitelesa). Po prejemu negativnih rezultatov pripraviti novo seme (prehod) materiala. Okužba enoslojne plasti celic in vrednotenje rezultatov se izvede s standardnimi metodami.

Metoda diagnostične dodelitev klamidije v celični kulturi je treba uporabiti v celotnem obdobju bolezni, razen za obdobje antibiotiki in za 2-3 mesece. po njem. Za nadzor zdravilo, da bi opredelili uspešne klamidijo, ki lahko uveljavljajo svojo celotno življenjsko dobo, se ta metoda po 3 mesecih. po koncu zdravljenja.

VI. Metoda elektronska mikroskopija

Da se stvori diagnostično trajno klamidioza v metodi čeljustno sinusitis uporablja elektronsko mikroskopijo. Študija biopsijo materiala nosno sluznico in sinusa. V ta namen sekcije sluznice takoj po ograje so določeni v 2,5% glutaraldehid -tega 0,1 molarna kakodilatu pufru pri pH 7,4 2-24 ur. Po trikratnem spiranju v kakodilatu pufru dofiksiruyutsya 1% raztopino osmijevim tetroksidom za 1,5-2 ure. dehidracijo izvedemo v alkoholov naraščajočimi koncentracijami zdravil za 15-20 minut in impregnacijsko smolo v zmesi z Epona aralditom. Na koncu se polimerizacijo izvedemo v inkubator za 3 dni. pri 37 ° C in 60 ° C Potem ko so bile polimerizacije semithin odseki pripravljeni 1 mikronov debeline na ultratome LKB-3 (Švedska). Obarvajo rezine izvedemo po metodi, ki jo C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), metilen modro, modro-2 in osnovno fuksina za predogled in analize s svetlobnim mikroskopom (Ponidelko SN, 2001) predlagala. Hkrati fotografirati z uporabo photomicroscope «Opton» (Nemčija). Nato pripravimo ultratankih odseke 3700 Angstromov debele, je na svojem bakra očesi, med 200 in nato v nasprotju z nasičeno 30% raztopino etanola in rok citrat (Reynolds). Oddelki so bile pregledane na podlagi elektronskega mikroskopa «JEM 100S» (Japonska) na pospeševalni napetosti 80 kV, s povečanjem X5, X10, X30, X50 tisočkrat. Foto uporablja film tipa FT-41p (Rusija).

Za diagnozo klamidijo lezij obnosnih sinusov, je treba uporabiti poseben diagnostični algoritem.

Osnovno načelo diagnostične iskanja je njegova tristopenjski.

V prvi fazi študije preverjanja serumu pacientov z sinuzitis za detekcijo klamidije protiteles, ki kažejo na stalno okužbe z ELISA in RNIF in preverjanje rodu Chlamydia (C. pneumoniae, C. trachomatis, prašičji pikomavirusi).

V drugi fazi preko PID in PCR izvedemo direktno pri diagnozi klamidijo žarišč (nosne votline in obnosnih votlin) in levkocitov periferne krvi za določitev generalizirana okužba.

V tretji fazi diagnosticiranja z uporabo CM ugotoviti antibiotike občutljivost sredstev.

Ta algoritem je bila testirana v raziskavi 97 bolnikov, vključno s tistimi, s kronično čeljustno sinusitisa predstavljali 28 ljudi, 39 je bilo pri bolnikih s ponavljajočim se akutno čeljustno sinusitisa in 30 - ne trpijo zaradi bolezni zgornjih dihalnih poti in vstopil v kontrolno skupino. Primerjalni informativeness različne laboratorijske metode za diagnozo klamidijske okužbe med skupinami anketiranih podatki predstavljeni v tabeli.

Primerjalni informativeness različne laboratorijske metode za diagnozo klamidijske okužbe v sinusitis

metoda	klamidioza
metoda	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	samo
vzajemni sklad	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

Kot je razvidno iz predstavljenih podatkov v materialu iz bolnike z diagnozo klamidije poliklonalni skupini specifična sredstva proti Chlamydia protiteles v 59 (60,7%) bolnikov. Vendar pa je uporaba drugih diagnostičnih tehnik dovoljeno za njihovo popolno identifikacijo. Če je izbrana približno enaka frekvenci odkrivanje S. pneumoniae in C. bolnikih trachomatis v materialov iz sinusitisa (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

Tako rezultati primerjalne študije metod za diagnozo klamidioza pokazala visoko frekvenco detekcijo klamidije z čeljustno sinusitis, ki omogoča opredelitev "Chlamydia etiologije sinusitis" in prepoznajo številne klinično sliko, značilno za to skupino bolezni.

"Bolezni, poškodbe in tumorske maksilofacialne"
ed. AK Iordanishvili

Zdieľať na sociálnych sieťach:

Príbuzný