Kri radioimunski (RIA) prijava

Leta 1956 so prvič odkrili pri bolnikih, zdravljenih z insulinom, nepretsipitiruyuschie Protitelesa, ki veže ¹³¹I-insulin. Potem je ta raziskovalna skupina pokazale, da neoznačeni inzulin tekmuje z označenega protitelesa za vezanje na in ga premakne iz imunskih kompleksov. Nato Berson in Yalow razvil prvi metoda za merjenje RIA koncentracije insulina v serumu, za katerega so bile dodeljene Nobelovo nagrado. Pri tej metodi je bil inzulin veže na protitelesa ločimo od nevezane insulina s papirno elektroforezo. Približno v istem času, leta 1960., Grodsky in Forsham opisujejo metode, podobne pomočjo RIA ¹³¹I-insulina, ki pa ločitev vezanega in nevezanega hormona, smo se uporabljajo namesto soljenja elektroforeza.

Ogromno prispevalo k razvoju RIA Hales in Randle iz leta 1963 za ločevanje vezanega in nevezanega hormon se uporablja za preprečevanje y-globulin tako imenovanih sekundarnih protiteles. Ta pristop temelji na delu Skom in Talmadge je leta 1958 pokazala, da sekundarna protitelesa obarjanje kompleksov "antigen-primarna protitelesa." Hales in način Randle, imenovano "metodo dvojnega protitelesa", se je izkazalo, da je veliko bolj občutljiva in specifična od prejšnjih različic RIA.

Leta 1963 je Herbert sod. Razvili smo tehniko za ločevanje kompleksov "antigen-protitelo" iz nevezanega antigena z aktivnim ogljem prevlečeni s dekstrana. Metoda temelji na premoženju dekstran zmesi oglja v bistvu sprašuje absorbirajo prosti antigen, brez vezave z kompleksov antigen-protitelo. Ta tehnika omogoča, da se ločijo imunske komplekse veliko byst7 yardarm kot tehnik pretsipitatsionnye, tako da ga lahko uporabljate ¹³¹I-antigeni z nizko specifično dejavnost, ki jo Hunter in Greenwood označeni.

Video: Naučite risanke Winx?

Hkrati Utiger sod. razširiti spekter aplikacij RIA, razviti metodo za kvantitativno človeški rastni hormon. Kasneje Greenwood et al. izvršljiv postopek po jodiranje STH, ki omogoča, da dobimo označeno hormon s specifično aktivnostjo 200- 500 mCi / mg (6000-9000 Ci / mmol).

Ta tehnika se danes še vedno uporablja. Njegovo bistvo je v tem, da je izotop jod (1311 ali 1251) v sestavku natrijevega jodida oksidirane s kloraminom T, in v tej obliki nadomesti enega ali več atomov vodika v fenilnem obroču tirozina in histidin imidazolnega obroča. Po 1 min reakcijsko zmes dodamo redukcijsko sredstvo, da se izognemo nepotrebnemu poškodbe hormona. Upoštevajte, da je načelo oksidativno jodiranje proteinov opisano v Hughes 1957 V nadaljnjem Meyer Knobil in razvita za merjenje RIA od opičjega in humanega rastnega hormona, pri čemer je aktivno oglje, ki se uporablja za ločevanje nevezan hormona.

Izvor RIA za merjenje ravni gonadotropnih hormonov (v tem primeru - LH), oblikovanimi v 1966, na podlagi uporabe protiteles proti humanega CG, saj je bilo predhodno prikazano, da ta protitelesa se vežejo na humani in LH. Eden od poskusov na tem področju je naredila pravo revolucijo v imunokemija: Catt et al. Ugotovili smo, da so protitelesa lahko držijo diske diazotiranih polistirena. Tako odpravi potrebo po ločitvi kompleksov antigen-protitelo kompleksa z obarjanjem ali adsorpcijo. Kasneje Catt et al. spoznanja imobiliziranega protitelesa direktno z nenasičenim polistirenom v alkalnem mediju. Rezultati teh študij je služil kot osnova za oblikovanje ELISA (gl. Spodaj). Faiman in Ryan prvič uspelo, da bi dobili protiserum na hipofizi gonadotropin - človeško LH. Pozneje RIA za določanje rat LH so bili razviti.

Razvoj RIA za merjenje ravni FSH, kot v primeru LH, začnejo z mislijo na prihodnje kliničnih raziskav. Leta 1967 in 1968. več raziskovalnih skupin so poročali o novih metodah RIA za različne oblike človekovega FSH. Vsi so bili na podlagi metode dvojnih protiteles.

Leta 1967, Aria in Lee prvič objavil metodo določanja prolaktina, ki temelji na metodi dvojnih protiteles. Prvo merjenje ravni prolaktina z RIA so bile izvedene v odsotnosti človeškega materiala pri ovcah in goveje plazme.

Teoretične osnove RIA

Prve metode RIA (npr metode Berson in Yalow ali Grodsky in Forsham) so temeljile na pojav kompetitivno inhibicijo. Ta pojav je v tem, da vezavo izotopsko označene hormona (sledilni antigen) s specifičnimi protitelesi inhibirana v prisotnosti neoznačenega hormona (neoznačena antigen). Pojav kompetitivne inhibicije lahko opišemo z dvema enačbama: "označeno antigen + protitelo kompleksu je označen z" in "neoznačena antigen + protitelo <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Značilno RIA izvedemo pri 4 ali 37 ° C v fosfatno-pufrski slani vodi pri pH 7 ali 8. Reakcijo lahko traja od 2 do 24 ur (odvisno od afinitete protitelesa in želeno stopnjo občutljivosti). Upoštevajte, da avtomatizacijo analize in izboljšane metode za proizvajanje protiteles znatno zmanjša reakcijskega časa. Ko reakcijsko zmes, ki se ravnotežje sedež, se kompleksov antigen-protitelo ločimo z obarjanjem s sekundarnimi protitelesi, antigeni in absorpcijo prostih protiteles na aktivnem oglju ali obarjanjem v mediju z visoko gostoto, kot je polietilen glikol. Če trdno fazo RIA se inkubacijski medij enostavno odstranimo in kompleksov antigen-protitelo ostane polistirena ali drugo trdno fazo. V zadnjem koraku radioaktivnosti kompleksi. Če je hormon, ki plujejo pod zastavo ¹²⁵I ali ¹³¹I, z uporabo nasprotni sevanja, če je nalepka vroči 3H, delci uporabi scintilacijskega števca. Koncentracija hormona v vzorcih izračunamo iz umeritvene krivulje, pripravljene iz meritev v standardnih vzorcev z znano koncentracijo hormona.

Priprava protiteles

Poliklonsko protitelo pripravimo z imunizacijo RIA antigen (hormon) živali različnih vrst, vključno z zajci, kokoši, morske prašičke, race, ovce in koze. Za primarno protitelo (anti-hormon) običajno uporabljajo pri kuncih in morskih prašičkih za sekundarnih protiteles (anti-primarno) - ovce in koze.

Video: Alergije na psa pudelj pasme

Obstaja veliko načinov za cepljenje, najpogostejši - injekcijo antigen v blazinico ali v regionalne bezgavke ali vranice. Ker v gostiteljici obstajajo antigenov za kratek čas, za zanesljivo indukcijo imunskega odziva z uporabo Freudov adjuvans. Neimunogenski antigeni nizko molekulsko maso (npr steroidni hormoni) in antigenov z nizko imunogenosti pred imunizacijo vezan na velike molekule ali delcev (metilalkohola albumin in feritina, dekstran, Sephadex in m. P.). Cepljenje se običajno izvaja v več stopnjah z intervalih po 2 tednih. Značilno je, da po nekaj injekcijami titer protiteles v serumu hitro narašča. Kri za imunskega seruma, odvzetih iz votline srca ali venah in arterijah ušesu. Slednja metoda se najpogosteje uporablja pri zajcih. Nastalo seruma smo inkubirali 30 minut pri 57 ° C, da se uniči komplement. Nato se serum dodamo konzervans, da prepreči rast bakterij in gliv (natrijev azid ali timerosal).

monoklonska protitelesa

Leta 1975, Kohler in Milstein razvil popolnoma nov - hibridoma - tehnologije za proizvodnjo protiteles. Kasneje se je ta razvoj prejel Nobelovo nagrado. Opisali smo glavne elemente te tehnologije.

Miši ali podgane imunizirali z antigenom, kot je hormon. Ko titer protiteles v serumu dobi dovolj visoko imunskih živali iz vasi Zenk Izoliran plazemskih celic med katerimi obstajajo celice - proizvajalci protiteles prvotnega antigena. Plazemske celice in vitro hibridizirali mielomom celic, pridobljenih živali iste vrste. Celično suspenzijo smo prenesli v selekcijskem mediju, v katerem le hibridne celice preživijo in plazme in nye mielomske celice poginejo. Hibridni stati eno posejali v vdolbino klorovodikove srednje podajalnik kadar jih delimo in tvorijo hibridomov (imortalizirane celične linije). Med množico izbrati tiste hibridomov, ki proizvajajo protitelesa za želeni antigen, in večkrat njihovo hranilnega medija ali trebušne votline singenskih miši. Od pitatelno- mediju ali ascitesa izoliranega protitelesa. Ta protitelesa so, imenovanih monoklonska ker jih proizvajajo z hibridomom potomci enega samega plazemske celice. Monoklonska protitelesa, proizvedena s hibridomom, prizna le en epitop antigena. To je bistvena razlika med monoklonskimi protitelesi iz poliklonskega antiseruma, ki navadno vsebuje več različnih protiteles proti različnim determinantam antigenov.

Ena izmed pomembnih prednosti monoklonskega protitelesa proti poliklonskih je v tem, da se isto vrsto monoklonskih protiteles z določeno specifičnost in afiniteto lahko v poljubni količini in praktično neskončna (kot nesmrtno hibridom). V nasprotju s tem, zmes za protitelesa poliklonskimi antiserumi je zelo spremenljiva, ki ga je treba preveriti vsako novo serijo antiseruma in izbiro pogojev njegove uporabe. Tako je uporaba monoklonskih protiteles veliko lažje standardizirati RIA in drugih imunoloških testov.

Pridobivanje hormoni, ki so radioaktivno označena

Kot je bilo že omenjeno, za iodization proteinskih hormonov najpogosteje uporabljena metoda, ki Greenwood in Hunter predlagano. Sprva se uporablja kot oznaka ¹³¹Sem, ampak zato, ker na kratko razpolovno dobo tega izotopa (8 dni), je rok označenega hormona je bila majhna. Leta 1967 Wilde sod. uporablja za iodization ¹²⁵I (T_1/2 = 60 dni). Od takrat izotop uporablja za označevanje katerikoli protein, in nekatere nebeljakovinskih hormone. Tako pridobljeni označeni hormonov s specifično aktivnostjo 100-250 mCi / mg. To zadošča za zanesljivo detekcijo delcev v števec sevanja.

Za označevanje neproteinski uporabe hormona in drugih radioaktivnih izotopov, kot so radiatorji delci ³H ali ¹⁴C. označeni ³H ali ¹⁴C steroidi se uporabljajo le v imunokemijsko analizo hormonov, temveč tudi v temeljnih endokrinimi študij, na primer za študij lokalizacije steroidnih receptorjev v različnih celicah in tkivih poskusnih živali.