Preimplantiranih genske diagnostike

Njena kombinacija s testom za anevploidije lahko izboljša rezultate IVF. DNA vgnezditvijo genodiagnostic pripravljeno iz polarnega telesa, biopsijo korak drobljenja bodisi zigota biopsije blastociste v.

Analiza DNK se izvaja na polarnem telesu postopka v fazi oocit II. Glavna pomanjkljivost te metode je v tem, da je treba za potrditev genotip zarodka, je potrebno prenatalna diagnoza. Rekombinacija izmed kromosomov v 1. mejotskih delitev lahko povzroči napačne diagnoze. V večini centrov opraviti biopsijo zarodkov, ki lahko zazna bolezen, podedoval od obeh staršev. Biopsija snov običajno dosežemo v stopnji drobljenja zigota (korak osem celic) izbiranje celic 1-2. Zaradi težav v zvezi z diagnozo za takšnega omejenega materiala (glej. V nadaljevanju), v najboljšem primeru bolje biopsijo blastociste, saj vsebuje do 300 celic. Poleg tega se lahko biopsijo treba trofoblast celice, ker so bolj dostopne in da ne vpliva na pravilen razvoj zarodka. Vendar pa se blastociste biopsija ne izvajajo v vseh centrih zaradi kompleksnosti njenega gojenja celic v kulturi in zmanjšano preživetje blastocist po zamrzovanju. Vendar pa z uporabo te metode, pa je mogoče doseči nosečnosti, in v daljšem časovnem obdobju, z izkušnjami, njihova učinkovitost je verjetno, da vzhaja.

Material dobiti pri biopsiji, analizirani z enim izmed dveh načinov: PCR ali fluorescenčno hibridizacije in situ. Laboratoriji, ki izvajajo takšne teste mora imeti potrdilo v svojem poročilu navede, katera metoda je bila uporabljena, pa tudi rezultat dekodiranje rezultatov. Kljub temu, specialist rodnosti je zelo pomembno razumeti molekularne in genetske metode predimplantacijsko genodiagnostic, njihovih vlog in njihovih povezanih slabosti.

PCR

PCR je najbolj primerna za diagnosticiranje od monogenskih zabolevanij ga uporabljajo za določanje spola zarodka je tudi, čeprav bo to zdaj bolj uporabljajo fluorescenčne hibridizacije in situ. Za identifikacijo s PCR mutacijo v določenem genu, je treba pred IVF vedeti, kaj iskati mutacij, in predizbor reakcijski pogoji. V vsaki reakciji je treba vključiti v ustrezne pozitivne in negativne kontrole, sicer rezultatov ni mogoče zaupati. Treba je opozoriti, da lahko pri reakciji se številni izzivi, vključno z:

1. Odsotnost PCR produkta;
2. kontaminacije vzorcev;
3. izguba alelov.

Poleg tega v mnogih centrih, če nameravate zaprositi za pred vsaditvijo diagnostično PCR, zatekla k intracitoplazemski injekciji sperme, da bi se izognili morebitnim napakam pri diagnozi z uvedbo tulec dodatnih sperme povzročil.

Ker preimplantiranih genodiagnostics število matrične DNA za PCR ni dovolj - običajno nekaj pikogramov, ker se običajno v PCR sto nanogramih uporablja, je potrebno povečati število pomnoževalnih ciklov. Če PCR DNK vzeta iz ene same celice (ali več celic) pogosto zahteva 35-60 ciklov, medtem ko standardni PCR (ko količina vzorca ni omejujoč dejavnik) - približno 30. Druga rešitev je, da PCR z ugnezdenih primerji (ali eden nested primer): dva zaporedna reakcije za pomnoževanje majhne količine ciljnega šablone. V zadnjih letih smo uporabili oligonukleotidov, s fluorescentno oznako za analizo zelo majhnih količin DNA, s čimer se izboljša občutljivost PCR je približno 1000-krat in s tem zmanjšanje števila ojačanja ciklov.

Da bi odpravili onesnaženje vzorca je treba zelo skrbno pripravljeno in reakcijsko zmes imajo reaktsiyu- dodajanje v reakciji, vključujejo negativno kontrolo (reakcijska zmes, ki vsebuje vse sestavine razen DNK). Če se ugotovi negativna kontrola PCR produkt, možnost kontaminacije vzorca tuje DNA - v tem primeru, PCR posledico ostalih vzorcev, ki se ne more zaupati. Ker uporaba oligonukleotidov s fluorescentnim številom deklarirano količino PCR ciklov manjša verjetnost kontaminacije vzorca spodaj.

alel izguba pomeni, da je dopolnjena v bistvu ena izmed alelov, medtem ko je druga dopolnjena zelo slabo ali ne razširja na vse. Očitno je, da ima največjo vrednost pri prepoznavanju bolezni z avtosomno dominantnega dedovanja. Če je "izgubil" dominanten alel vsebuje mutacijo, je lahko napaka v analizi privede do prenosa zarodka v maternično votlino, ki vsebuje mutirani gen. Lahko istočasno ojači drug razmaknjenih DNA fragment, ki ima visoko stopnjo polimorfizma (multipla PCR) Da bi se izognili temu problemu. Poleg tega, kot je bilo že omenjeno, lahko izboljša občutljivost PCR uporabo začetnih oligonukleotidov s fluorescentno oznako.

Združenje preimplantiranih genodiagnostics Evropska skupina za humano reprodukcijo in embriologijo (ESHRE) je ocenila diagnostično točnost PCR in fluorescenčne hibridizacije in situ. Po letih 1999-2001., V 81 vgnezditvijo genodiagnostic primeru, ko smo PCR izvedemo z uporabo pred- ali poporodne diagnostika- kjer je napaka pri diagnosticiranju bolezni podedovano v Mendlove zakonodaje odkritih v 5 primerih (6,2%). Ponavljajoče diagnostika za potrditev rezultatov je bila izvedena le polovico predimplantacijsko diagnoze. Prav tako je treba upoštevati, kadar je bilo mogoče opraviti biopsijo ali nemogoče diagnosticirati.

Fluorescentno in situ hibridizacijo

Ta metoda je sestavljena s tem, da sonda (enojni DNA), ki nosi fluorescentni marker, hibridizira na DNA iz denaturiranega metafazi pladnju, posameznih celic ali tkiv. Postopek se lahko uporabi v ugnezditvijo gena diagnosticiranju:

1. zarodkov določanju spola pri boleznih-X vezana, ni nobene možnosti, da izvede PCR;
2. odkrivanje kromosomskih premestitev;
3. zazna spremembe v številu kromosomov;
4. odkrivanje drugih kromosomskih nepravilnosti, kot so anevploidije.

V študiji anevploidije o morebitnih tehničnih težav, povezanih z opredelitvijo števila kromosomov. Če za analizo so povzeti posamezni medfaznih celice, je težko natančno določiti število signalov (z drugimi besedami, kromosomi), ko issleduesh ena sama celica. Če vidite samo en signal, lahko to pomeni, monosomijo o tem kromosomu, ampak tudi prekrivajo signale ali da hibridizacija sonda z enim izmed kromosomov ni uspelo. Podobno lahko prisotnost treh ali več signalov pomeni trisomija, lahko pa je zaradi tehničnih težav: dvojnim signalom vida ali nenormalno fluorescence. Za razširitev zmogljivosti diagnosticiranja lahko hkrati uporablja vsaj tri sonde: na kromosomu X, Y kromosom in autosomes eden od primer iz 18. kromosomu. V tem primeru, bi moral laboratorij vedno strogo nadzorovati kakovost hibridizacije za diagnostične natančnosti je bila tako visoka, kot je to mogoče, saj je znano, da v študiji 100 normalnih diploidnih celic 100 parov signalov za vsakega kromosoma ne bodo mogli prejeti. Diagnostični zmogljivosti bo razširila, če bo mogoče analizirati večje število celic.

V tem detekcije metode za prenose običajno uporablja sond spremljajočih translokacijo ali prijemalne položaj. Ker se takoj po pripravi za IVF oocit polarnih kosi vsebujejo kondenzirane metafazne kromosomske sonde lahko uporabimo za "Slika" kromosomih v kombinaciji z centromerne sond, da odseki (a satelitskih ponovitev) in nekatere lokusov. Na žalost, celice iz faze cepitve na zigota ali do blastociste, take sonde so neprimerne, ker so kromosomi ne more biti v metafazo in premalo zlit. Postopek, v katerem so sonde uporabi za subtelomeric regije kromosoma specifično kromosomsko translokacijo pojavlja med njimi, in centromerne kot sonda, proksimalno glede na mestu translokacije. Take sonde lahko zazna v medfaznih celice dekompenzirano translokacijo, vendar ne more razlikovati med normalnim kromosoma, ki kromosomskih prenosov s kompenzirano.

Po podatkih Združenja za preimplantiranih genodiagnostics evropske skupine za razmnoževanje pri ljudeh in embriologijo, fluorescentno in situ hibridizacijo dvoma napačen rezultat v 8 primerih 145, ko je po ugnezditvijo diagnoza opravi pred- ali poporodna (5,5%). Med napačne diagnoze - dva primera trisomijo, en mozaik trisomija, A monosomijo in eno nadomestilo in dekompenzirana translokacij. Poleg tega je bila študija o anevploidije neodkrita trisomija kromosoma 21. Kot v primeru s potrditvijo PCR fluorescence Rezultati hibridizacije in situ smo izvedli v manj kot polovica žensk, ki so prestali ugnezditvijo genske diagnostike.

Vloga fluorescence in situ hibridizacije pri ugotavljanju premestitev danes ni jasno, saj je 50-70% primerov, ko so starši nosilci kompenzirane vzajemne prenose, ko so zarodki dekompenzirana študija Translokacija. Ti objavljeni podatki o incidenci uspešne nosečnosti po raziskavah precej razlikujejo, vendar pa po podatkih iz treh glavnih centrov pogostosti nosečnosti v smislu jemanja eno jajce, je 29%. Nekateri avtorji poročajo, da je pred ugnezditvijo genske diagnostike zmanjšuje tveganje za spontani aborta-, vendar ni jasno, ali se poveča hitrost uspešnem zaključku nosečnosti v primerjavi z naravno zanositvijo, saj je več kot polovica zarodkov bodo imeli nepravilnosti in s tem bolj verjetno, v vsakem primeru, ne bo preživela. Kljub temu, da je pred ugnezditvijo genske diagnostike za test za anevploidije je bila večkrat uporabljena z zunajtelesno oploditvijo, nobena od objavljenih randomiziranih prospektivnih študij ni pokazala znatno povečanje števila uspešen izid nosečnosti. IVF s predimplantacijsko diagnozo - invaziven in drag postopek, zato je pomembno, da natančno razmejiti praktično vlogo te metode.

Društvo za preimplantiranih genodiagnostics Evropske skupine za humano reprodukcijo in embriologijo

Potegniti prave zaključke iz rezultatov predimplantacijsko genodiagnostic s PCR in fluorescenčno hibridizacija izvedli in situ, v praksi še vedno ni vedno mogoče. Glede na poročilo Združenja za preimplantiranih genodiagnostics Evropske skupine za humano reprodukcijo in embriologijo za od leta 1999 2001 dveletno., Ki se izvajajo v 1197 ECO ciklov, kot kažejo rezultati naknadnega pred rojstvom ali po rojstvu, diagnozo, preimplantiranih genske diagnostike z uporabo PCR dal napačen rezultat na 5%, in z uporabo fluorescence hibridizacija in situ - 6% primerov. Prav tako je treba upoštevati, da naknadno diagnozo izvedemo manj kot pol ure, tako da se število napačnih diagnoz prenizka. Vendar pa ti podatki ne pomeni, da je v 94% primerov je pravilno diagnozo. Po mnenju združenja je bila skupna stopnja zanositve po žetvi jajc 17%, biopsija je bil uspešen v 97% primerov, diagnoze in lahko imajo le 86% primerov. V celoti, to pomeni, da je bila pravilna diagnoza predimplantacijsko diagnoze je približno 85% primerov. Tisti, ki so tik pred ugnezditvijo genske diagnostike, je treba opozoriti, da je v 15% primerov, pravilna diagnoza ne more dati.