Terapija za delovanje genov, ki so odgovorni za sintezo proteinov aktina in srčne distrofinske na razvoj kronične srčne odpovedi pri bolnikih s dilatativna kardiomiopatija miokardni miokardai

DDa bi razumeli mehanizme razvoja in napredovanja okvare hronicheskoyserdechnoy (CHF) raziskave poslednihlet osredotočiti na ocenjevanje prispevka genetskih dejavnikov vrazvitie žilni neuspeh. Perspektivnympodhodom To je posledica dejstva, da se odkrije genetski tveganja in proiskhoditprognozirovanie zapletov bolezni do njihovega klinicheskihproyavleny [1, 2]. Tako je sedaj na molekularnem patogenezo kardiomiopatije urovnerassmatrivaetsya kot proiskhoditnarushenie v procesu genske ekspresije, zlasti mehanizmovpretranslyatsii, prevajanje in posttranslyatsii ki vodi do izmeneniyufenotipa [2]. Znano dela za opredelitev genetske faktorovrazvitiya CHF pri bolnikih z dilatativna kardiomiopatija (DCM), zlasti pri teh bolnikih pokazala mutacije na različnih uchastkahgenov odgovorne za sintezo distrofinskem proteina in aktin [3, 4,5, 6].
Ni objavljenih poročil o mutatsiigena distrofinske in aktina pri bolnikih z miokardnim infarktom, hotyamozhno domnevo, da je mogoče podobno mutacijo pod vliyaniemstressa in nevrohormonske mehanizmov aktiviranja.
V zvezi s tem je cilj dela je issledovaniegenov aktina in distrofinske pri bolnikih z idiopatsko dilatativna kardiomiopatija, yu oseb z miokardnim infarktom.

Materiali in metode

V issledovanievklyucheno 130 bolnikov, vključno s 104 moških in 26 žensk, vozrasteot 21 do 88 let. Bolnike smo razdelili v tri skupine: 1. koncernu macrofocal in bolnikih z akutno transmuralnim srčnega infarkta s komplikacijo CHF II - IV fC NYHA, 2 skupini - z miokardnim miokardabez kliničnimi znaki srčnega popuščanja, 3. skupino- bolnikih z idiopatsko dilatativna kardiomiopatija CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo skupina 30 ljudi, med njimi 21 moških in 9 žensk, vozrasteot 25 do 76 let (povprečna starost 55.5 let) brez srca in sosudistoypatologii in brez hudih kroničnih bolezni.
Klinične in demografske značilnosti bolnyhpredstavlena tabele.
Študija genov aktina in distrofinske proizvodilosv Institute of General genetiko, laboratorijsko in okoljsko radiatsionnoygenetiki inštituta za biologijo RAS gena.
tselnayakrov uporabimo za ekstrakcijo DNA, sprejetega v epruveto z EDTA do končne koncentracije 50mMili citrata s končno koncentracijo 0,5%. Izolacija provodilis DNA z uporabo "DiatomTMDNA Prep 200" Reagenčni komplet (z "Biokom" izdelan). Osnova izolacije DNK uporabo te naboralezhit uporabo lizo reagenta na DNK guanidintiotsionatomi sorbent "Nucleos". V prisotnosti visokih koncentracij guanidintiotsionata (4M) DNK adsorbirajo na aktivno površino delcev "Nucleos" in preostale sestavine krvi ostane v mediju, ki je nato udalyayutsyatsentrifugirovaniem. DNA izperemo spirtosolevym blažilnika zatemsmyvaetsya extragenic sorbenta z zmesjo ionskim izmenjevalcem in določanja napryamuyuispolzuetsya verižne reakcije s polimerazo (PCR) izolacija DNK iz popolne krvi izveden v skladu z nizom instruktsieyispolzovannogo "DiatomTMDNA Prep 200" "Biokom" zagotovljeno.
Za odkrivanje mutacij v metodi gen kardioaktinaispolzovali PCR-RFLP, PCR produkta čemer rezhetsyasootvetstvuyuschey omejitveni encim, priznava točko kraji nukleotidnuyuzamenu. Z restrikcijsko encimsko Bcl I restrikcijskega mesta (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutacije G (norm) K (mutacije) raztopili v 5-eksonu gena kardioaktina povezano z idiopatsko dilatativna kardiomiopatija. Sintezpraymerov za raziskave 5. eksonu je kardioaktina imajo sintetizator PE Applied Biosystems (ZDA). Sestava primerji: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR pomnoževanje smo izvedli kot sledi rezhimeamplifikatsii: 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 do 30 ciklov.
Velikost pomnoženega fragmenta 222 parynukleotidov. Končne koncentracije PCR reakcijski zmesi: 67 mMTris Hcl c pH = 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20.1 enote. Taq.polimerazy, 200 mM dNTP vsak 0,5 mM vsakega primerskega 10-20ng DNA preiskati, 1,5 mM MgCl₂,Končni volumen PCR zmesi 30 ml.
Za analizo ojačanja Rezultati 10 mklPTsR produkt smo nanesli na 2% agaroznem gelu. vgele DNK razvita z etidijevim bromidom pod UV svetlobo z valovno dolžino od 32 nm. Po vizualnih ocen PCR zmes PCR koncentracija proizvodov opredelyaliobem potrebnih za nastavitev restrikcijsko reakcije (5 do 10 l PCR Zmes).

Preiskovanje gena distrofinskem

Za obnaruzheniyamutatsii v distrofinskem genu, ob uporabi metode PCR z sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), pri čemer ispolzuetsyapara za PCR primerje, od katerih eden vsebuje enega ali dva tochechnyezameny. Eden izmed menjav je zanimiva zamenjava tochechnuyunukleotidnuyu. Princip metode je, da se temperatura prioptimalnoy žarjen primerji v odsotnosti mutacije pojavi poseben pas produkta PCR, in v primeru mutatsiipri enaki temperaturi in žarjenje primerji amplifikatsiine zato poteka. Izbrana dva para sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny za odkrivanje missense mutacijo A do G v 9. ekzonegena distrofinske običajnega zaporedja in mutacije sootvetstvennosvyazannaya s-X vezan idiopatsko dilatativna kardiomiopatija.
Sinteza oligonukleotidov za raziskovanje 5. ekzonakardioaktina je bila izvedena na sintetizator PE Applied Biosystems (ZDA).
Sestava primerjem: Dn 5-GTA AAT GT GAC AGA cctgtg 5-gaa CCT CTC TCG CAG ATC AcG Dm 5-GTA AAT GT GAC AGA cctgtg 5-GGA TCC TCT CTC GCA GAT CGC
PCR pomnoževanje smo izvedli kot sledi rezhimeamplifikatsii: 950S - 40 s, 560c - 30, 740S - 40 za 35 ciklov.
Velikost pomnoženega fragmenta 160 parnukleotidov. Končne koncentracije PCR reakcijski zmesi: 67 mMTris HCl c pH = 8,8 16 mm (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20.1 enote. Taq polimeraza, 200 mM dNTP vsak 0,5 mM vsakega primerskega 10-20ng DNA preiskati, 1,5 mM MgCl₂,Končni volumen PCR zmesi 30 ml.
Tabela. Klinične in demografske značilnosti bolnikov.

Za analizo rezultatovamplifikatsii 10 ul produkta PCR smo nanesli na 2,5% agaroznem gelu pokazala elektroforez.DNK gel z etidijevim bromidom pod UV svetlobo dolgo volny320 nm.
Za odkrivanje točkovne mutacije v issleduemyhprobah zabeležene amplifitsirovannogofragmenta prisotnost ali odsotnost ustreznim parom začetnih oligonukleotidov:
1. Prisotnost PCR fragmenta 160 parov nukleotidovpri pomnoževanje oligonukleotidni pobudnik par za normalno posledovatelnostiukazyvaet na normo.
2. Odsotnost fragmenta PCR z 160 parnukleotidov pomnoževanja oligonukleotidni pobudnik par za normalnoyposledovatelnosti označuje prisotnost nameravani mutacije.
3. Prisotnost PCR fragmenta 160 parova nukleotidovpri pomnoževanje primerski par za mutatsieypodtverzhdaet sekvence z mutacijo.

Rezultati in diskusija

Kot je bilo omenjeno, v literaturi ni poročil o mutacijo distrofinske gena iaktina pri bolnikih s koronarno srčno boleznijo, zlasti sinfarktom infarkt, čeprav pod vplivom nevrohormona in drugih biologicheskiaktivnyh snovi, ki se aktivirajo kot odziv na povrezhdenieserdechnoy mišice (v tem primeru, miokardni infarkt), vozmozhnopredpolozhit podobno mutacija. Kljub pogoji pravilnyeteoreticheskie in našimi pričakovanji, je bilo ugotovljeno, mutacije genov bolnikov proučevanih. Poleg tega, ne opredelyalasmutatsiya in pri bolnikih z dilatativna kardiomiopatija, čeprav je v zadnjih letih na področju raziskav rezultateryada dobiti dovolj dobre rezultate, ustrezno kotoryekasayutsya distrofinske genske mutacije in aktin z srca nedostatochnostyu.V zlasti, R. Ortiz-Lopez et al. [2] raziskovali genomnuyuDNK 3 nepovezanih družin s-X vezan dilatativna kardiomiopatija.Kontrolna skupina je bila sestavljena iz 50 ženskih posameznikov in 50 moških neyavlyayuschihsya sorodniki. Za pomnoževanje DNA smo uporabili PTSR.V rezultat študije v eni od družin s-X vezan DKMPbyla označene gen, ki kodira mutacija distrofinski lokalizuyuschegosyav kromosoma 21, zlasti najde zamenjavo adenin guaninv eksona 9 pri legi 1043, kar je privedlo do sinteze hidrofobnega nepolyarnoyaminokisloty alanina namesto hidrofilnega polarnem treonin, prisotnega v distrofinske v položaju 279, v zvezi KN-terminalni konec proteina distrofinske. Nadomestitev treonina z alaninom izmeneniyupolyarnosti vodi do N-koncu proteina in s tem spremembo vtorichnoyi distrofinskem terciarne strukture. Tako mutatsiyayavlyaetsya to povzroči izgubo stabilizacijo membran motenj delovanja etogobelka in funkcionalno aktivnost kardiomiocitih, chtoi vodi k-X povezane degenerativne bolezni miokarda- X-vezano dilatativna kardiomiopatija.
F. Muntoni et al. [4], in Milasini J. s sod. [5] so opisane mutacije v drugih mestih distrofina.Eti gena odseki so bile preiskane R. Ortiz-Lopes et al. [3] tehzhe 3 družine s-X vezan dilatativna kardiomiopatija, so mutacije v teh mestih vyyavlenone. Zato lahko razmišljamo o različnih mehanizmov veduschihk razvoj distrofinopaties.
Tako vsaka mutacija distrofinaprivodit s pomanjkanjem miokardnega proteina, ki yavlyaetsyaprichinoy odsotnost miokarda distrofinassotsiirovannyh glikoproteinov [7, 8], odgovornih za vezavo kompleksu multiproteinnogo sbelkami ekstracelularni matriks. Rezultat tega yavlyaetsyadezorganizatsiya kardiomiociti, kar je privedlo do sprememb v mehanicheskoymodeli infarkt, motnje njegove črpalno funkcijo in srčnega popuščanja.
Kot je za mutacijo srčnega aktina, tovariš leta 1998 objavil članek, T. Olson in sod. [6] je razvidno iz študije dve nepovezani semeys avtosomno dominantnega idiopatske kardiomiopatijo (en semyanemetskogo izvora, drugi - za švedsko-norveško). Za vsehchlenov izvedemo ehokardiografijo, biopsiyamiokarda, diklorometan prepoznajo značilne lastnosti (osrednja interstitsialnyyfibroz in kardiomiocitne hipertrofija). Za odkrivanje mutacij genov aktina PCR smo uporabili. dva enojna gen mutatsiietogo označene: eno - v genu za kardioaktina 5. ekson (zamenjava guaninana adenin, ki vodi do kodira sintezo histidina pri 312 mpolozhenii namesto arginina) in drugi - v 6. ekson (zamenjava adeninana gvanina, ki izhaja pojavila sintezo 361-položaj glutamin glitsinavmesto). Vendar pa bi se te spremembe upoštevati vramkah kardioaktina gena polimorfizem. Da bi izključili takšno predpolozheniyaprotestirovany 435 nepovezanih ljudi, opisane mutacije, ki jih ni bilo vyyavlenou. Zato te izvedbe assotsiiruyutsyaimenno aktin gen z idiopatsko dilatativna kardiomiopatija.
Dejstvo, da naše delo ni bilo mogoče zaznati mutatsiyagenov aktina in distrofinske ni neposredna izjava, da mutacija ni storil. Morda je mutacija se zgodi vbolee poznejših fazah bolezni? Treba je opozoriti, da je v nashemissledovanii ne izvajajo genetske analize v družinah z so bili idiopaticheskoyDKMP in nepovezane osebe. Verjetno za glubokihvyvodov potrebujejo tudi velike populacije v smislu issledovanie.I ne sme biti manj pomembnih študijskih geni drugihstrukturnyh sestavine srčne mišice, zlasti kollagenai elastina mutacije, ki lahko imajo tudi vrednost v razvitiiHSN.

Reference:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic genetski vidiki kroničnega srčnega popuščanja ivozmozhnosti popravek drog. / Diss. ... Dr. med. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M.R. Zakaj miokard ne? Insights iz osnovne znanosti. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H. Su J. Goytia V., Towbin J.A. Dokaz za distrofinskem missensemutation kot vzrok-X vezan dilatativna kardiomiopatija. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau M., Ganau A., Congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti C, Realdi G. Cao A., Melis M.A. Kratko poročilo: izbris distrofinskem mišično-promoterregion povezano z-X vezana dilatativna kardiomiopatija. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C, CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca M. in HMD Študijska skupina . Apoint mutacijo v 5` spojno mestu distrofinskem genu firstintron odgovoren za-X vezano dilatativna cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T.M., Michels V.V., Thibodeau S.N., Tai Y.S., Keating M.T. Aktina mutacije dilatativna kardiomiopatija, A dedne oblike srčnega popuščanja. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R.D., Maeda M., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer T. Young J. B. Campbell K.P. 5` distrofinski duplicationmutation povzroči pomanjkanje membransko alfa-dystroglycan v afamily s-X vezan kardiomiopatije. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer M. Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H.H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. in sod. X-vezana dilatativna kardiomiopatija. Novel mutationof distrofinskem genu. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.