Osnove molekularne terapije. genska terapija

Video: The molekularne osnove individualizacije terapije s pogostimi mutacijami nedrobnoceličnim pljučnim rakom

Vsebina

Video: the molekularne osnove individualizacije terapije s pogostimi mutacijami nedrobnoceličnim pljučnim rakom
Genska terapija

Vzpostavitev lokacijo in zaporedje genov, katerih mutacije povzročijo posebne bolezni, kot tudi večina sodobnih metod mutacije in njeno testiranje lahko diagnosticiranje bolezni v neo-in še pred rojstvom razvoj organizma. Tako je mogoče ublažiti manifestacijo genetske okvare z zdravljenja odvisnosti od drog, prehrana, transfuzijo krvi, itd

Vendar pa je ta pristop ne vodi do popravka napake in, na splošno, dedne bolezni ni mogoče pozdraviti. Položaj je zapleten zaradi dejstva, da lahko mutacija enega samega gena proizvajajo različne učinke na telo. Če je mutacija povzroči spremembo encimske aktivnosti, za katere kode, lahko privede do kopičenja toksične podlage ali, alternativno, s pomanjkanjem spojine potreben za normalno delovanje celic.

Dobro znan primer takšne bolezni je fenilketonurija. To je posledica mutacije v genu za jetrnega encima fenilalanindegidroksilazy katalizira pretvorbo fenilalanina do tirozina. Rezultat je povečana endogenega raven fenilalanina v krvi, ki povzroča nepravilno formaciji mielinske ovojnice okrog aksonov živčnih celic centralnega živčnega sistema in kot rezultat, hude duševne zaostalosti.

Če mutacija vpliva gen strukturno beljakovin, potem je to lahko privede do resnih motenj na ravni celic, tkiv in organov. Primer takšne bolezni je cistična fibroza.

Črtanje v genu, ki kodira protein, ki se imenuje cistična fibroza prevoznik vodi k sintezi okvarjene beljakovine (pomanjkanje fenilalanina 508) in motnje prevoza kloridnih ionov skozi celične membrane. Ena izmed najbolj škodljivih posledic tega je, da se sluz, ki vodi in varuje pljuča, postane nenormalno gosta. To otežuje dostop do celic v pljučih in prispeva h kopičenju škodljivih mikroorganizmov. Celice obloge dihalne poti v pljučih, umre in nadomestiti s vlaknastega brazgotine (od tod ime bolezni). Kot rezultat, bolnik umre zaradi odpovedi dihal.

Dedne bolezni razlikujejo kompleksne klinične simptome in njihovo zdravljenje je traditsinnoe predvsem simptomatično: za bezalaninovuyu zdravljenje fenilketonurijo predpisano dieto, zamenjati okvarjene funkcionalne proteine z intravenskim dajanjem, kot nadomestilo za izgubljene funkcije opravljene presaditve kostnega mozga ali drugih organov. Vsi ti ukrepi so običajno neučinkovite, drage, vzdržljiv in malo bolnikov preživi s starostjo. Zato je razvoj novih terapij je zelo nujna.

genska terapija

Genska terapija se imenuje genetski inženiring človeških somatskih celic, katerih cilj je odpraviti genetsko napako, ki povzroča bolezen. Popravljanje posebnih bolezni izvedemo z uvajanjem v napako celice običajnih somatskih izraženih genov. Da bi čez 80 let. Ko so ustvarili razvite metode za pripravo posameznih genov in evkariontskih izražanja vektorji, postane rutinskih prenos genov poskuse na miših, genetske popravek perspektive postanejo resnična.

Leta 1990 je v ZDA dr W. francoski Anderson (W. francoski Andrson) prvi poskus genske terapije za zdravljenje huda kombinirana imunska pomanjkljivost (SCID) v triletnem dekle Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) so bile narejene. Ta bolezen povzroča mutacijo v genu, ki kodira adenozanadenilazu (ADA). Pomanjkanje tega encima omogoča kopičenje adenozin in deoksiadenozin krvi, katere strupene ukrep vodi do smrti limfocitov B in T v periferni krvi in kot posledica imunske pomanjkljivosti.

Otroci s to boleznijo, je treba zaščititi pred okužbami (iz posebnih sterilnih komorah), kot katerakoli bolezen lahko usodna. 4 leta po začetku zdravljenja je otrok opazili izražanje normalno delujoče ADA SCID in lajšanje simptomov, ki ji je omogočila zapustiti sterilno komoro in živi normalno življenje.

Tako je bilo dokazano, načeloma možnost uspešnega genskem zdravljenju somatskih celic v. Od 90-ih. testirali več genske terapije genetskih bolezni, med katerimi so najtežje, kot hemofilija, AIDS, različne vrste malignih neoplazem, cistične fibroze in drugih. Trenutno ozdravljive hrbet transgenezo približno 10 človeških bolezni.

Različne genetskih bolezni vnaprej določeno množino razvoj genske terapije pristopov. Tako rešiti dva glavna problema: sredstvo za zagotavljanje terapevtsko gena- metode za zagotavljanje ciljno dostava celic, namenjenih za korekcijo. Do danes lahko vsi pristopi genske terapije somatskih celic lahko razdelimo v dve kategoriji: (. Slika 3.15) ex vivo terapijo in vivo.

Sl. 3.15. Shema ex vivo genske terapije (a) in in vivo (a)

ex vivo genska terapija vključuje korekcijo genetski defekt celic zunaj telesa in nato vrne normalno delovanje celice v telesu.

in vivo genski terapiji vključuje dostavo terapevtskega gena direktno v celice določenega tkivu pacienta. Razmislite o teh pristopov podrobneje.

ex vivo genska terapija vključuje naslednje korake:
1) zagotovitev celice pomanjkanjem pacienta in njihovo gojenje;
2) prenos želenega gena v izoliranih celic s transfekcijo terapevtskega gena konstrukta;
3) izbiro in zmogljivosti genetsko popravljene celice;

4) presaditev ali transfuzijo teh celic v pacienta.

Z uporabo pacientovih lastnih celic zagotavlja, da po vrnitvi ni razvila imunski odziv. Prenos Postopek gen Konstrukt mora biti učinkovita, toda normalen gen je treba ohraniti stabilno in stalno izražena.

Sredstva za prenos genov, ki jih narava ustvarila, so virusi. Da bi dosegli učinkovito vektorje gen dostave za dve skupini virusov se uporabljajo predvsem - (. Glej sliko 3.16) adenovirusi in retrovirusi. gensko razstrupljajo različice virusov, ki se uporabljajo v genski terapiji.

Sl. 3.16. Virusi, ki se uporabljajo za izdelavo terapevtske vektorjev

Razmislite napravo in uporabo modelov, ki temeljijo na retro-virusi. Spomnimo, da je retrovirusni genom vsebuje dva identična enoverižnih RNA molekule, od katerih je vsak sestavljen iz šestih odsekov: dva dolga terminalna ponovitev (LTR) na 5` in 3` konča nekodirano sekvenco * P + potrebne za pakiranje RNA v virusni delec, in tri regije, ki kodirajo strukturne protein notranje plaščne (gag) reverzne transkriptaze (pol,) in ovojnice protein (eNV) (sl. 3.17, b).

Sl. 3.17. Genetski zemljevid tipičnega retrovirusa (a) in retrovirusni vektor zemljevidu (a)

Spomnimo, da je retrovirusni življenjski cikel obsega naslednje korake:
1. Okužba ciljnih celic.
2. Sinteza kopije DNK genoma z nativno reverzne transkriptaze.

3. Prometni virusne DNA v jedru.
4. Vključevanje virusne DNA v kromosoma gostiteljske celice.
5. Naprava mRNA iz virusne DNA pod kontrolo močnega promotorja lokalizirani na 5`-LTR odseka.
6. Broadcast beljakovine Gag, Pol in Env.
7. tvorbi virusne kapside in paket dveh RNA molekule verige in reverzne transkriptaze.
8. sprostitev virionov iz celice.

Pri pripravi retrovirusni vektor dolžine retro virusa DNA vstavljena v plazmid odstranimo večino gena gag in popolnoma gene pol in env in namesto vstaviti "terapevtsko" gen t in po izbiri markerski selektivno gen RG z lastnim promotorjem (sl. 3.17, b ). Gen T Naprava se krmili isti močnega promotorja lokalizirani na 5`-LTR odseka. Na podlagi te sheme zagotavlja različne retrovirusni vektorji, in največjo velikost vložka DNA okoli osem tisoč. Bp

Tako dobljena struktura se sam po sebi lahko uporabijo za transformacijo, vendar je njegova učinkovitost in posledično integracija v genom gostiteljske celice, je zelo majhna. Zato je bil razvit embalaža tehnika celotno RNA retrovirusni vektor v intaktnih virusnih delcev, ki z visoko frekvenco v celico in prodrejo zagotovljena integriran v genom gostitelja. Za te tako imenovane "pakuyuschaya" celične linije je bila ustanovljena. Dve različni deli kromosomih celic sešiti retrovirusni gene gag kakor pol-env, odvzeto sposobnost zlagajo zaradi pomanjkanja doslednosti + (84 * +) (sl. 3.18).

Sl. 3.18. Shema za pridobitev pakirani virusni vektor

To pomeni, da so prepisani obeh fragmentov, vendar hkrati prikrajšani za RNA praznih kapsid. Z transfekcijo virusni vektor RNA v teh celicah je vključena v kromosomsko DNA, ki je prepisana, da dobimo celotno dolžino RNA retrovirus, in pod temi pogoji, pakirano v kapsid v samo RNA vektorja (samo vsebuje sekvenco +). Dobljene intaktne virusne delce uporabimo za učinkovito dostavo retrovirusni vektor v tarčni celici.

Retrovirusi okužijo le aktivno deljive celice v veliki meri. Za prenos njihovih genov smo obdelali s prečiščenimi delcev pakirana retrovirusni vektor ali ko-kultiviranih s celično linijo, ki jih proizvaja in nato opraviti izbor za ločevanje tarčnih celic in pakirni celici.

Transducirani celice temeljito preveri stopnjo terapevtskega sinteze gen izdelka, odsotnost pristojnega retrovirusne replikacije, brez sprememb na sposobnost celic, da rastejo ali funkcijo.

Posebno primeren za gensko terapijo so celice kostnega mozga. To je posledica prisotnosti totipotentnimi embrionalnih izvornih celic, ki lahko razmnožijo in se razlikujejo različne vrste -B- celice in T limfocite, makrofage, eritrocitov, trombocitov in osteoklastov. Te celice se uporabljajo za zdravljenje številnih dednih bolezni, med njimi smo že omenili hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo, Gaucherjeva bolezen, anemija srpastih celic, talasemijo, osteoporoze in drugih.

Poleg totipotentnimi izvornih celic kostnega mozga, ki jih je težko izolirati in gojiti rabljeno pupovinnoy izvornih celic iz krvi (prednostna uporaba genske terapije za dojenčke s) in jetrnih celicah - hepatocitih - za zdravljenje hiperholesterolemije.

V vivo genski terapiji je zlasti pomembno zagotoviti dostavo terapevtskega gena do pokvarjenih celic. Takšen ciljno dostavo zagotavljajo lahko spremenijo vektorji, ki temeljijo na viruse, ki lahko okužijo posebne vrste celic. Razmislite pristop, razvit za zdravljenje že omenjeno cistično fibrozo. Ker so pljuča odprto votlino, terapevtskih genov dostaviti jih je relativno enostavno. Kloniran Varianta zdravega gena je bil uveden v inaktiviranem adenovirusa (sl. 3.19). Posebnost te vrste virus, ki okuži sluznice pljuč, ki povzročajo prehlad.

Sl. 3.19. Shema za pridobitev vektor, ki temelji na adenovirusa

Zasnovan tako je bil virus testirali z razpršitvijo v nos in pljuča poskusnih živalih in nato ljudi pacientom. V nekaterih primerih je uvajanje in ekspresijo zdravega gena in obnovo normalnega transporta kloridnih ionov. Morda je ta pristop (uvedba normalnega gena, ki ga nosne aerosola), v bližnji prihodnosti bo na široko uporablja za zdravljenje simptomov cistično fibrozo v pljučih.

Poleg retroaktivno in adenovirusi v gensko zdravljenje poskuse o uporabi in drugih vrst virusov, kot so herpes simplex virusom. Značilnost te dvojne vijačnice (152 tisoč evrov. Bp) virus DNA je njegova sposobnost, da posebej prizadela nevrone. Obstaja veliko genetske bolezni, ki vplivajo na centralni in periferni živčni sistem - tumorji, metabolične motnje, nevrodegenerativne bolezni (Alzheimerjeve bolezni, Parkinsonove bolezni).

Herpes simplex virusa tipa I (HSV) vektor je zelo primerna za zdravljenje teh bolezni. Kapsid virusa zlije z membrano nevronov in DNK se transportira v jedru. Predlagala je več načinov prenosa terapevtski gen preko HSV-vektorjev in uspešno preizkušeni na poskusnih živalih.

Virusni vektorji imajo več pomanjkljivosti: visoki stroški, omejene zmogljivosti kloniranih in morebitnih vnetnih reakcij. Torej, v letu 1999, kot rezultat, ki je razvil nenavadno močan imunski odziv na adenovirus vektor je bil ubit 18-letni prostovoljca, ki so sodelovali v poskusih drog. Leta 2002, dva otroka v Franciji med zdravljenju imunske pomanjkljivosti (uvedba terapevtskih genov v matičnih celic, ki uporabljajo retrovirusi) je razvil stanje podobno levkemijo.

Zato je razvil nevirusnega sistem gen dostave. Najenostavnejši in najbolj neučinkovit način - je injekcija plazmidne DNA v tkivo. Drugi pristop - je microprojectile obstreljevanje tkanine zlato (1-3 mikronov) konjugiran DNK. Tako so terapevtske gene, izražene v ciljnih tkivih in njihovih izdelkov - terapevtskih proteinov - vstopijo v krvni obtok. Glavna pomanjkljivost tega pristopa je prezgodaj inaktivacija ali uničenje teh proteinov z komponent krvi.

Dostava DNK je mogoče doseči tako, da jo pakiranje v umetno lipidno membrano. Tako dobljene sferične delce, lahko liposome lahko prodrejo skozi celične membrane. Liposomi ustvarjena z različnimi lastnostmi, vendar do sedaj učinkovitost takšnega dostave je nizka, saj je bila večina DNA izpostavimo lizosomov degradacijo. prav tako sintetiziramo DNA konjugatov za dostavo genetskega konstrukta z različnimi molekulami, ki lahko zagotovi njegovo varnost, usmerjeno dostave in prodiranje v celico.

V zadnjih letih intenzivno poskusi ustvariti umetno kromosom 47, kar bi omogočilo, da se vključi veliko genskega materiala s polnim naborom regulatornih elementov za enega ali več terapevtskih genov. To bi bilo mogoče uporabiti genomske različico terapevtskega gena in s tem zagotoviti njegovo stabilnost in učinkovito dolgoročno izraz. Poskusi so pokazali, da je ustvarjanje umetnih človeških kromosomov, ki vsebujejo terapevtske gene realni, vendar pa ni jasno, kako taka ogromna molekula uveden v ciljno celično jedro je.

Glavni problemi z gensko terapijo soočajo, poleg tveganje resnih imunskih reakcij težko dolgotrajno skladiščenje in delovanje terapevtskega DNA v bolnikovo telo, veliko multigensko bolezni, zaradi česar jih je težko ciljanje za gensko terapijo, in tveganje uporabe virusov kot vektorjev.

NA Bojevniki, TG Volova

Zdieľať na sociálnych sieťach:

Príbuzný