Hematološki učinki nove aktivnosti mutirane p53 v celičnega cikla, apoptoze in občutljivosti za citostatikov

Kršitve funkcije p53 so najbolj vsestranski v različnih tumorjev molekulyarnymizmeneniem osebe. Lahko voznikatlibo tudi v normalnih celicah in s tem povečuje veroyatnostobrazovaniya neoplastične klon njim, ali pa uzhev tumorske celice in določi nadaljnji napredek novoobrazovaniya.Sleduet poudariti, da s spreminjanjem kletochnogotsikla kontrolnih točk in apoptozo UREDITEV, p53 disfunkcija spreminjanje chuvstvitelnostkletok za proti raku drog.

Praviloma v tumorjih pokazala missense mutacijo p53, je privodyaschiek eno aminokislino nadomesti druga, in z največjim chastotoymutatsii najdemo v treh "žarišča": Kodonah175, 248 in 273. Verjetno je izraz mutiranega p53 pripisuje kletkedopolnitelnye selektivna prednost v celicah, v katerih sprememb v p53 gena vodijo do alel za izgubo ekspressiipovrezhdennogo. To dejstvo lahko razložimo z krayneymere dveh razlogov. Prvič, mutantni protein prevladujoč negativnymeffektom proti divjemu tipu proteina, t.j. mutatsiyadazhe točke v enem od dveh alelov lahko popolnoma zatre ohrannuyufunktsiyu p53. Drugič, v zadnjih letih pa so podatki, ki kažejo na obstoj mutiranim oblikam p53 novo pridobljenih dejavnosti ("pridobili-of-funkcijo"). Znano je, npr da za schettakih dejavnosti mutiranega p53 lahko natančno in z vysokoyaffinnostyu povezovalne MAR / SAR DNA elementov, ki povzroča remodelirovaniehromatina, trans aktivirali nosilce več genov (onkogensko myc epidermalni rastni faktor receptor in drugi.) In uvelichivatmetastatichesky potencial tumorskih celic. Vendar molekulyarnyeosnovy novo pridobljene aktivnosti in njihova vloga je praktično ni bilo raziskano pri kantserogenezapoka procesih.

Poskušali smo, da preuči vpliv na novo priobretennyhaktivnostey mutiranim p53 o ureditvi celičnega cikla, apoptozai občutljivost na citostatikov. V ta namen smo raziskali effektymutantnyh substitucije p53 aminokislin v kodoni 175, 248 ili273 čemer "žarišča" razlichnyhopuholyah mutacije pri ljudeh. Novi mutantni p53 aktivnost smo dokazali s transdukcijo v kultiviranih celicah in vitro brez produtsiruyuschieendogenny p53. Uporaba celic nimajo p53 ekspressiyaendogennogo, možno odpraviti obstoj prevladujočega-negativnogoeffekta in raziskati vpliv na novo pridobljeno le aktivnosteytransdutsirovannogo mutant p53.

Dobili smo in derivati ​​človeških celic analizirali myshii konstitutivno ali tetraciklinski-repressible ekspressieyekzogennogo p53. V slednjem primeru ekspresijo mutantnega r53podavlyalas dodajali tetraciklin v mediju kulture (1mkg / ml). 24-48 ur po kontaktiranju prenos subliniykletok dobljenega v mediju brez indukcije tetraciklin opazili ekspressiiekzogennogo mutantni p53 ne spremlja povečan ekspressiigenov ciljno divjega tipa p53 (p21WAF1 et al.).

Vpliv novih dejavnosti mutant p53 v celičnem ciklu stopnja proliferacije celic

Na novo pridobljena mutant p53 dejavnost povzroča suschestvennoeuvelichenie stopnjo proliferacije celic. Tako uvajanje vektorja konstitutivno izraža mutantno p53-His175, povyshaetskorost razmnoževanje p53-negativna murine fibroblastov linii10 (3) je približno 1,5 :. zmanjšal s 23,5 ur do 16 ur v logaritmični fazi rasti celična populacija je opazovalo vremyaudvoeniya Shodnayakartina v primeru, tetraciklin regulirano ekspressiir53-His175 v pljučni karcinom humani celični liniji N1299ili mišje fibroblastnega liniji 10 (1), ki je potrdila svyazvyyavlennyh razlike v hitrosti proliferacije natančno ekspressieymutantnogo s p53, in ne s katerokoli sekundarnih sprememb voznikayuschimiv rezultat stalnega izbire z eksogene mutantnymr53 celicami. Treba je poudariti, da je indukcija ekspresije divjega tipa p53 mobilnih kontekstih ni privedlo do zmanjšanja ampak uvelicheniyuvremeni podvojitev populacije celic ali apoptoze.

Pospešitev proliferacije celic pod vplivom novo priobretennyhaktivnostey mutiranim p53 je posledica, očitno, njihova ureditev vozdeystviemna celični cikel. Analiza kinetiko pojavljanja mechenyhmitozov po dodatku 5-bromdeoksiuridina 20 min., Smo opredelyaliprodolzhitelnost posamezne faze celičnega cikla rasti logarifmicheskoyfaze. Ugotovljeno je bilo, da vključitev ekspresijo mutantnega r53znachitelno zmanjšuje čas za celičnega ciklusa trajanje skrajšanje schetsuschestvennogo S-faza. Tako mutantnyyr53 občutnega učinka na trajanje drugihfaz za celičnega ciklusa.

Na novo pridobljeno mutant p53 aktivnost, poleg izmeneniyregulyatsii na celičnega cikla v normalnih fizioloških pogojih, se lahko spremeni G1-kontrolne točke funkcija aktivirajoče povrezhdayuschimivozdeystviyami. Ugotovili smo, da je indukcija ekspresije mutantnogor53-His175 celic 10 (1) in H1299 vodi k dejstvu, da je S-fazuvhodit 1,5-2-krat več celic s poškodbo DNA, indutsirovannymialkiliruyuschim spojina etil metansulfonat (EMS), nato p53 divji kakekspressiya tipa, nasprotno, zmanjšuje delež povrezhdennyhkletok vključena v s-fazi. Ob istem času, p53-His175 prakticheskine vpliva na aktivnost checkpoint, ki deluje v G2.

Mehanizmi smo opredelili učinke novo pridobljeno aktivnosteymutantnogo p53 v uredbi celičnega cikla, dokler neyasny.Naibolee verjetna je predpostavka, da ti izmeneniyasvyazany s sposobnostjo p53-His175 poveča izražanje genamyc. Njegov produkt, kot je bilo predhodno prikazano, lahko, po eni strani, trans aktivirali gen ornitin dekarboksilaze in kliče, s čimer bolezni, skrajševanje S-fazi, in na nasprotni strani aktivirati kompleksytsiklin E / CDK2 in prekliči stop poškodovane celice v perehodeiz G1 v S .

Vpliv novih dejavnosti mutant p53 indukcijo apoptoze

Mutant p53 lahko spremeni učinek citostatikov, le izmenyayane predpis G1-kontrolno točko, temveč tudi slabi indukcijo apoptoza.Pri to novo aktivnost mutiranega akta p53 kot naapoptoz povzročajo poškodbe DNA in apoptozo s inducirane"smrt domena" ("smrt receptorji") V gojišče posledobavleniya TNF-a ali anti-Fas. Sleduetpodcherknut da taki učinki mutiranega p53 v veliki stepenizavisyat na specifičnih aminokislinskih substitucij, kot apoptoze in morda celičnem okolju. Tako p53-His175, močneje kot p53-Trp248 ali p53-His273, inhibira apoptozo z DNA povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, etopozid) inducirana. Hkrati je p53-His273 močnejši od p53-His175, zavira izmed Fas-inducirane apoptoze pri prostate rak chelovecheskihkletkah liniji PC-3. Poleg tega različni mutantnyer53 različno vplivajo na apoptozo inducirano fasi TNF-a.

Mehanizmi delovanja na novo pridobljenih aktivnosti na področju urejanja apoptoze mutantnyhr53 študiral še precej slabo. Nedavnoobnaruzheno da eden od načinov take ureditve lahko yavlyatsyatrans BAG1-aktivacijo gena, ki kodira antiapoptotic beloksemeystva BCL 2.

Vpliv novih dejavnosti mutant p53 v drog kemoterapijo chuvstvitelnostk

Poleg nespecifičnih učinkov na občutljivost za tsitostatikamposredstvom spremembe v regulaciji celičnega cikla in apoptozo, novyeaktivnosti mutantni p53 imajo lahko več občutljivost spetsificheskoedeystvie do nekaterih zdravil sredstvamputem spremembe v regulaciji ciljev kemoterapijo. Uporaba hibridizacija metodsubtraktivnoy smo identificirali neznano raneemisheni transaktivacije mutante delovanja p53 in ugotovili, da je skupina genov specifično aktivira mutiranega gena p53 vključuje kodiranje deoksi-UTP-ASE. Funkcija dUTFazy zaklyuchaetsyav hidrolizo dUTP damping in pirofosfat. Po drugi strani pa, da nastane smetišče sluzhitsubstratom DTTP de novo. Predpostavlja se, da lahko povyshenieurovnya dUTFazy povzroči odpornost na 5-fluorouracil, shirokoprimenyaemomu kemoterapevtikov, katerih mehanizem delovanja z inhibicijo sinteze svyazans DTTP timidilatsintetazy.My s supresijo aktivnosti ugotovili, da indukcijo p53-His175 ali p53-His248, kot tudi uvedbo konstrukta izražanje UTP -azu tudi v vseh preiskovanih kultur (pljučni karcinom H1299 s, rakyaichnika Skov-3, fibroblastni 10 (1) do 1,5-2-krat večja chislokletok sposobni tvoriti kolonije po izpostavitvi 5-fluorouracil a.Pri to odpornost na dveh različnih drog - metotreksatui adriamicin - ni povečala hkrati s p53-His273, neobladayuschy sposobnostjo trans aktivirali gen UTP-ASE ne uvelichivalustoychivost podatkov celične kulture do 5-fluorouracil ..

Očitno je, da obstajajo tudi drugi načini, v katerih je mutant p53 dejavnost vnovpriobretennye vpliv chuvstvitelnostkletok nekaterim citostatikov. Tako smo ugotovili, da vleykoznyh K562 celice, v nasprotju s celičnimi 10 (1) in sod., Izražanje p53-His175 povzroči znatno chuvstvitelnostik zmanjšanje metotreksat. Izražanje tega mutanta nekaj odpornosti uvelichivalatakzhe od levkemije celic na vinblastin akcijskega noprakticheski je ni spremenila občutljivost na etopozidom. Hkrati je izraz p53-His273 ni znižala, ampak nasprotno, več povyshalachuvstvitelnost K562 celic do metotreksatom in vinblastina. Mehanizmyetih učinki ostajajo nejasne.

Tako smo ugotovili, da na novo pridobljena aktivnostimutantnyh p53 aminokislinske substitucije v različnih položajih razlichnymobrazom vpliva na občutljivost na različnih zdravil kemoterapijo. Prietom lahko razlikujejo ne le učinkov različnih mutant p53 vode in isto vrsto celic, ampak tudi dejanje istih mutantav celic različnega izvora. Vse to je potrebno uchityvatpri stalne poskuse ispolzovatmutatsii p53 napovedati rezultate kemoterapije za zdravljenje raka.